ミトコンドリアは、細胞のエネルギー産生、カルシウム調節、アポトーシスの中心的役割を担っているため、パーキンソン病（PD）の病態だけでなく、他の神経疾患においても重要な役割を果たしている。 これらのオルガネラの機能不全は、PDに特徴的なドーパミン作動性ニューロンの死に至る複雑な過程に関与していることが示されている。 6-OHDA、ロテノン、アンチマイシン、MPP+を含むいくつかの神経毒は、ミトコンドリアの機能障害を誘発するために一般的に使用されている。
SCANTOXでは、異なる病変を組み合わせた複数のアッセイがセットアップされています。 細胞モデルだけでなく、ミトコンドリアマーカーも利用できる：
- ドパミン作動性ニューロンを選択的に標的とする神経毒である6-OHDAは、酸化ストレスを誘発し、複合体I活性を障害することにより、ミトコンドリア機能を破壊する。 これはATPの枯渇と活性酸素種（ROS）の発生につながり、最終的に神経細胞の死につながる。
- ミトコンドリア複合体Iの強力な阻害剤であるロテノンは、電子輸送を阻害し、その結果、ATP産生が減少し、活性酸素の発生が増加する。 このミトコンドリア機能の障害は、PD患者で観察されるミトコンドリア機能障害を反映しており、ドーパミン作動性ニューロンの変性に寄与している。
- ミトコンドリア複合体IIIの阻害剤であるアンチマイシンは、呼吸鎖内の電子の流れを阻害し、ミトコンドリアの機能障害と活性酸素の産生を引き起こす。 このミトコンドリア活性の障害は神経細胞障害を引き起こし、PD発症に関与している。
- MPTPの代謝産物であるMPP+は、ミトコンドリア複合体Iを阻害し、ATP産生を阻害し、酸化ストレスを誘発することによって、ドーパミン作動性ニューロンを選択的に標的とする。 これがミトコンドリア機能障害と神経細胞死を引き起こし、PD病態の主要な側面を模倣する。
ミトコンドリア活性は、以下のような蛍光プローブを含む様々な技術を用いて測定することができる：
- TMRM （テトラメチルローダミンメチルエステル）とMitotrackerは、活性ミトコンドリアに選択的に集積するため、IncuCyte®ライブセルイメージングシステムを利用することで、生きた細胞のミトコンドリア膜電位と機能を経時的に評価することができます。
- DCFDAと MitoSOXは 、それぞれ酸化ストレスレベルとミトコンドリア特異的活性酸素産生を評価するために利用される。 DCFDAは細胞全体の活性酸素レベルを測定し、一方MitoSOXはミトコンドリアを特異的に標的とし、ミトコンドリアの酸化ストレスに関する洞察を提供する。
- JC-1は、MPP+のようなPD特異的神経毒に関連したミトコンドリア膜電位変化を評価するために一般的に使用されている。 JC-1はミトコンドリア膜電位変化を定量化することができ、PD発症におけるミトコンドリア機能障害の理解に貢献する。
すべてのアッセイは、様々なタイプの細胞で実施できる：
- SH-SY5Y細胞は、ドーパミン作動性ニューロンのモデルとしてよく用いられるヒト神経芽腫細胞株である。
- げっ歯類の一次皮質ニューロンや海馬ニューロンから、一般的なニューロン反応についての知見が得られる。
- 腹側中脳からのネズミの一次ニューロン、特にPDに直接影響を受けるドーパミン作動性ニューロンに焦点をあてて
- iPSC 由来ニューロン、人工多能性幹細胞由来ニューロンは、ヒトに特異的な文脈を提供し、発見を臨床応用につなげるために不可欠である。
Scantoxでは、これらのアッセイを頻繁に実施しており、お客様の次の研究プロジェクトの特定のニーズに基づいてワークフローを適応させることができます。
図1：TMRM（テトラメチルローダミンメチルエステル）を用いて評価したマウス大脳皮質初代ニューロンのミトコンドリア活性。 A：経時的なTMRMの積算強度。 データはデータ点＋平均値の標準誤差（SEM；各群n=8）で示した。 B：24時間のTMRMの積算強度の曲線下面積（AUC）。 データは、平均の標準誤差（SEM；群あたりn＝6）を伴う棒グラフとして示される。 MK-801は参照項目とした。 統計解析には、MPP+病変に対する一元配置分散分析（One-way ANOVA）とダネットのポストホック検定を用いた。 ***p<0.001。
図2：ビヒクル（左）およびMPP+（右）で浸漬したマウス大脳皮質一次ニューロンのTMRM蛍光の代表的なビデオ。
これらのin vitro PDモデルで貴社の化合物の有効性を評価させていただければ幸いです！