α-シヌクレイン（α-syn）はパーキンソン病（PD）の病因に重要な役割を果たすタンパク質であり、A53T変異を含むこのタンパク質の変異は早期発症PDと関連している。
健康な神経細胞では、α-synはシナプス機能と神経伝達物質放出の制御に関与していると考えられている。 しかし、PDでは、α-synはミスフォールディングと凝集を起こし、レビー小体として知られる不溶性のタンパク質沈着物を形成する。 これらの凝集体はPDの病理学的特徴であり、α-synの凝集体またはオリゴマーが黒質のドーパミン作動性ニューロンの進行性変性に関与していることが示唆されている。
さらに、オートファジー経路の調節障害は、PD患者やPD動物モデルの脳で観察されており、この疾患におけるオートファジーの重要な役割を示している。
α-synの凝集、播種、オートファジーのさまざまな側面を評価するために、スキャントックスでは以下のアッセイをセットアップしており、不死化細胞株、初代げっ歯類、ヒトiPSC由来ニューロンなど、さまざまな細胞系で使用できるように変更することができる。
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細胞死または播種を誘導するためのプレフォームドフィブリル（PFF）またはオリゴマーの適用
リコンビナントヒトα-syn線維は、in vitroで大脳皮質マウス初代ニューロンの播種特性を評価し、毒性を誘発するのに使用できる。
単量体のヒトα-synは細胞の生存率に影響を与えないが、あらかじめ形成された野生型およびA53Tヒトα-syn線維は、マウスの初代皮質ニューロンに対して毒性を示す。 この毒性作用は、オリゴマーアイソフォームによって凌駕される（図1A）。 試験したアイソタイプのうち、A53T α-syn線維のみが大脳皮質マウスニューロンにおいて播種特性を示し（図1B）、これは免疫細胞化学的（図2）またはタンパク質解析のためのMesoscale Discovery and WESプラットフォームを利用した生化学的アッセイ（図3）のどちらかによって評価することができる。
このマウス細胞系では、ヒトα-synの代わりにマウスα-synを評価することで、適用したシードのシグナルが捕捉されるのを避けることができる。
図1：大脳皮質初代マウスニューロンにおけるα-synプレフォームドフィブリルのin vitro評価。毒性 (A）と播種特性 (B)皮質一次マウスニューロンに対する様々な組換えヒトα-syn予備形成種（StressMarq）の毒性（A）と播種特性。 A: α-syn種で処理し、MTTアッセイで細胞生存率を評価した神経細胞。 B: α-syn種で処理し、マウスα-synについて免疫細胞化学的に分析した神経細胞。 データは平均値の標準誤差（SEM）を伴う棒グラフで示した。 統計解析には、Dunnettのポストホック検定付き一元配置分散分析（One-way ANOVA）対ビヒクルコントロール（VC）を用いた。 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
図2：異なる予備形成ヒトα-syn種（StressMarq）で播種した後の内因性マウスα-syn蓄積の代表的画像。 神経細胞を単量体 (A)およびA53Tで形成されたフィブリル (B）で処理し、インキュベーション後にマウスα-synを免疫細胞化学的に染色した。 核染色DAPI＝青；マウスα-syn＝赤；スケールバー100μM。
図3：PFF刺激を受けたマウス大脳皮質一次ニューロンにおける可溶性および不溶性α-syn、ならびにpS129α-syn。 可溶性マウスα-syn (A）と不溶性マウスα-syn (B)をMesoscale Discoveryプラットフォームで解析し、pg/μgタンパク質として示した。 (C)WESで解析し、ビヒクルコントロール(VC)に対するパーセントで正規化したシグナルとして示した。 データは群平均＋SEMの棒グラフで表示した（各群n=6）。 UT：未処理、VC：ビヒクル対照、単量体α-syn処理細胞、LC：病変対照、PFF α-syn処理細胞。 統計解析には、一元配置分散分析（One-way ANOVA）と、病変コントロール（LC）に対するダンネットのポストホック検定を用いた。 *p<0.05、***p<0.001。
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αシヌクレインの凝集とオートファジーの評価
野生型α-syn（SH-SY5Y-SNCA）を過剰発現するSH-SY5Y細胞を安定にトランスフェクトすることで、一般的なα-syn凝集とオートファジーの変化に対する実験化合物の効果を評価することができる。
分化したSH-SY5Y-SNCA細胞を、発生化合物または参照項目とインキュベートし、その後可溶性および不溶性タンパク質を抽出するために採取する。
α-syn凝集の程度（図4 4）またはオートファジー・マーカーの発現（図 5）は、MESO QuickPlex SQ 120MM プラットフォームを用いるか、免疫細胞化学的に定量することができる。
図4：SH-SY5Y細胞および安定的にトランスフェクトされたSH-SY5Y-SNCAにおけるヒト可溶性および不溶性α-syn。 可溶性α-syn (A）と不溶性α-syn (B）をMesoscale Discoveryプラットフォームで分析し、ng/mLで示した。 データは群平均＋SEMの棒グラフで表示（各群n=6）。
図5：異なる処理後のSH-SY5Y-SNCA細胞におけるオートファジーマーカーp62/SQSTM1の定量。 ラパマイシンの効果 (A）またはクロロキン (B）がSH-SY5Y-SNCA細胞のp62レベルに及ぼす影響をMesoscale Discoveryプラットフォームで解析した。 データは群平均＋SEMの棒グラフで表示（各群n=3-6）。 VC：ビヒクルコントロール。 統計解析には、一元配置分散分析（One-way ANOVA）と、VCに対するダンネットのポストホック検定を用いた。 **p<0.01、***p<0.001。
これらのin vitro PDモデルで貴社の化合物の有効性を評価させていただければ幸いです！