神経変性疾患におけるミクログリアの重要性はよく知られており、そのためこれらの細胞は新たな薬理学的介入の標的として頻繁に用いられている。
ミスフォールドあるいは凝集したタンパク質の貪食は、試験管内で効果的に研究できる重要なターゲットである。
アミロイドβ
5xFADマウスの単離成体ミクログリア細胞に、pH感受性のpHrodo™ Red標識と結合したAβ1-42を添加すると、Incucyte® Livecellイメージングシステムで赤色蛍光の増加として測定可能な取り込みとリソソーム分解をモニターすることができる。
pHrodo™Red標識Aβ1-42を添加してからすでに8時間後、5xFADミクログリアは年齢をマッチさせた非トランスジェニックミクログリアと比較して2倍以上の蛍光強度を示し、これは5xFADミクログリアにおけるAβの強力な貪食作用を反映している（図1A）。非トランスジェニックミクログリアもAβ1-42の貪食作用を示すが、5xFADミクログリアのこの極めて強い貪食反応は時間とともに持続し、最後に細胞の上清中に残存するAβ1-42を測定することで確認された。5xFADミクログリアは、上清中のAβ1-42の 有意な減少として観察される非遺伝子組み換えミクログリアと比較して、有意に多くのAβ1-42を取り込んだ（図1B）。
図1：5xFADおよび非トランスジェニック（ntg）動物の単離成体ミクログリアにおけるAβ1-42貪食能の評価。 pHrodo™ Red標識Aβ1-42とIncucyte® Livecellイメージングを用いて、Aβ1-42貪食を48時間測定した（A）。48時間培養後、同じ細胞の上清から残存Aβ1-42を分析した（B）。平均値±SEM。A: 二元配置分散分析（Bonferroniのポストホックテスト付き）。B: 両側対応のないt検定; ***p<0.001。
あるいは、生後早期の初代ミクログリア、マウスミクログリア細胞株BV2（図2）、またはiPSC由来のミクログリアも、化合物処理に反応したAβ1-42の取り込みを評価するためのpHrodo™ Red貪食アッセイに使用することができる。
図2： pHrodo™ Red標識Aβ1-42とIncucyte® Livecellイメージングを用いたBV-2細胞におけるAβ1-42貪食の評価。 pHrodo™ Red標識Aβ1-42とインキュベートしたBV-2細胞の4時間後のオレンジ蛍光を示す代表的な画像。スケールバー200 µM。
タウプリフォームドフィブリル
凝集したAβと同様に、予め形成されたタウ線維（PPF）もpHrodo™ Redで標識することができ、貪食のライブモニタリングが可能である。
このセットアップでは、タウPFFを陽性対照として抗タウdGAE（297-391）抗体、または2つの異なる陰性対照（RI1およびRI2）のいずれかとインキュベートし、iPSC由来ミクログリアに添加して、タウPPFの貪食の違いをモニターした （図3）。
図3：タウdGAE（297-391）前形成線維（PFFs）SPR-461の貪食。 TI（抗ヒト切断タウフラグメント（AA297-391；dGAE）ポリクローナル抗体SPC-806D）およびRI（RI1：Novus Biologicals IgG Fcフラグメント抗体NBP2-47132；RI2：InVivoPlusヒトIgG1アイソタイプコントロールBP0297）の存在下および非存在下におけるiPSC由来ミクログリア細胞のpHrodo™ Red標識SPR-461 PFFの貪食。pHrodo™Red標識PFF単独（VC）またはTIもしくはRIとの併用で処理した細胞において、A：オレンジ色の対象物の数、B：オレンジ色のシグナルの積算強度を12時間経時的にモニターした。平均値±SEM（n=6）。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）およびダネットの多重比較検定（Dunnett’s multiple comparison test）。*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。
α-シヌクレイン前形成フィブリル
パーキンソン病における貪食活性を評価するため、ヒトiPSC由来のミクログリアをpHrodo™ Red標識α-シヌクレイン線維（PPF）とインキュベートした。
PPFを陽性対照としてウサギ抗ヒトα-シヌクレインポリクローナル抗体SPC-800D、または2つの異なる陰性対照（RI1およびRI2）のいずれかとインキュベートし、α-シヌクレインPPFの貪食の違いを観察 した（図4）。
図4：N末端アセチル化 α-シヌクレイン（α-syn）前形成フィブリル（タイプ1；PFFs）SPR-332の 貪食作用。 TI（ウサギ抗ヒトα-シヌクレインポリクローナル抗体；SPC-800D）およびRI（RI1：Novus Biologicals IgG Fcフラグメント抗体NBP2-47132；RI2：InVivoPlusヒトIgG1アイソタイプコントロールBP0297）の存在下および非存在下におけるiPSC由来ミクログリア細胞のpHrodo™ Red標識SPR-332 PFFsの貪食。pHrodo™Red標識PFF単独（VC）またはTIもしくはRIとの併用で処理した細胞において、A：オレンジ色の対象物の数、B：オレンジ色のシグナルの積算強度を12時間経時的にモニターした。平均値±SEM（n=6）。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）およびダネットの多重比較検定（Dunnett’s multiple comparison test）。*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。
さらに、他の疾患関連ペプチドやタンパク質をpHrodo™ Redで標識することも可能です。
したがって、5xFADマウスの成体および生後早期の初代ミクログリア細胞、マウスクログリア細胞株BV-2、iPSC由来のミクログリアは、in vitroでさまざまな凝集体の貪食を研究するのに適している。
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