ミクログリア細胞は神経炎症の中心的メディエーターであり、その活性化プロファイルを研究するためにはin vitroモデルが不可欠である。リポ多糖（LPS）はよく知られた強力なミクログリア活性化因子であり、その強力で一貫した作用から神経炎症研究に広く用いられている。それにもかかわらず、神経炎症という文脈では、LPSは部分的に非生理的な刺激となる。この問題に対処するため、LPSといくつかのサイトカインカクテルを比較し、in vitroでの複雑な炎症環境をよりよく模倣するために、神経炎症を誘発する効果を検証した。そこで本研究では、マウス（BV-2）およびヒト（HMC3）ミクログリア細胞株の異なる炎症性刺激に対する反応を比較した。細胞は、LPS、あるいはインターフェロンγ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン1-β（IL-1β）の組み合わせからなる5種類のサイトカインカクテルのいずれかで刺激され、刺激から24時間後に転写レベルおよびタンパク質レベルで炎症活性化が評価された。 ヒトHMC3細胞では、LPSおよび各種サイトカインカクテルがIL-1βおよびTNF-αのmRNA発現を有意に誘導するが、マウスBV-2細胞では、LPSがサイトカインカクテルに比べてIL-1βのmRNA発現をより高率に誘導する（図1）。 図1：ヒトミクログリアHMC3細胞またはマウスミクログリアBV-2細胞におけるサイトカインmRNA発現レベルに対する24時間のLPSまたはサイトカインカクテル処理の影響。 RT-qPCRで解析したHMC3細胞およびBV-2細胞におけるIL-1β（A、B）およびTNF-α（C、D）のmRNAレベル。各群n = 6。一元配置分散分析（One-way ANOVA）とダネットポストホックテスト（Dunnett`spost hoctest）の比較。p<0.05、***p<0.01、***p<0.001。 サイトカインの分泌レベルはヒトHMC3細胞とマウスBV-2細胞で異なる。例えば、LPSはマウスBV-2細胞でIL-6の分泌を強く誘導するが、ヒトHMC3細胞ではそれほど誘導しない。異なるサイトカインは、LPSか特定のサイトカインカクテルのどちらを刺激として用いるかによって、分泌レベルが異なる。IP-10分泌だけは、絶対値がかなり大きく異なるにもかかわらず、HMC3細胞とBV-2細胞の間で同様のパターンを示した（図2）。 図2：ヒトミクログリアHMC3細胞またはマウスミクログリアBV-2細胞におけるサイトカイン分泌に対する24時間のLPSまたはサイトカインカクテル処理の影響。 免疫吸着アッセイ（Mesoscale Discovery、MSD）により分析した、それぞれの細胞株におけるIL-6（A、B）、IL-8（C）、マウスホモログKC/GRO（D）、およびIP-10（E、F）の分泌レベル。平均値＋SEM。各群n = 6。一元配置分散分析（One-way ANOVA）後、Dunnett`spost hoc検定、またはKruskal-Wallis検定後、Dunnの多重比較検定による対ビヒクルコントロール（VC）。p<0.05、***p<0.01、***p<0.001。 これらの知見は、適切な刺激選択の重要性を強調し、ミクログリアの活性化における種特異的な差異を浮き彫りにした。同様の研究は、初代ミクログリアや脳スライスでも行うことができる。 従って、ヒトやマウスのミクログリア細胞は、抗炎症化合物のハイスループットin vitro スクリーニングのための、非常にトランスレーショナルな神経炎症モデルである。 ミクログリアの試験管内研究を開始するには、今すぐお問い合わせください！
げっ歯類におけるパーキンソン病（PD）モデルの一般的なアプローチには、ミトコンドリア複合体I阻害剤であるロテノンなどの神経毒が用いられる。マウスにロテノンを全身投与すると、急速にPD症状が誘発される。しかし、その結果はしばしばばらつきが大きく、頑健性に欠ける。 従って、尾状被蓋（CPu）へのロテノンの片側注射は、これまでのアプローチに代わる良い選択肢となる。ロテノンを注射すると、いくつかの行動テストで運動能力が低下するが、ドーパミン作動性シグナルの障害、神経変性の増加、活性化したミクログリアとアストロサイトーシスによって示される神経炎症も起こる。 詳細には、片側ロテノン注射前（ベースライン）、注射後2週間および4週間の3つの時点で、2つの運動行動テストでマウスをテストした。ロテノンを注射したマウスは、DMSOを注射したマウス（図1B）に比べ、4週間後の回転テスト（図1A）、2週間後の梁歩行テスト（図1B）においてすでに有意な運動能力障害を示した。 図1. ロテノン注射マウスにおける運動障害。 A:B: ロテノンまたはDMSO注射前（ベースライン）と注射2週間後および4週間後のビームウォークテストにおける1歩あたりのスリップ。平均値＋SEM（各群n=16-28）。二元配置反復混合モデルANOVAとボンフェローニポストホック検定により、各時点および各群内の時点を比較。**p<0.01, ***p<0.001,#p <0.05,###p <0.001。 さらに分析したところ、ロテノンを注射すると、注射したCPuではチロシン水酸化酵素（TH）レベルが低下したが、対側のCPuではTHレベルは生理的なままであった（図2A）。終末血漿サンプルのニューロフィラメント軽鎖（NFL）レベルを測定したところ、ロテノン注射マウスでは、注射からすでに2週間後にNFLレベルが有意に上昇していた。ロテノン注射から4週間後も、NFLレベルはDMSO注射マウスと比較して有意に増加していたが、ロテノン注射2週間後に採取した血漿と比較してレベルは減少していた（図2B）。 リン酸化α-シヌクレインレベルを組織学的に評価した結果、ロテノンを注射した半球のCPuにおいて、残基Ser129でリン酸化されたα-シヌクレインレベル（pSer129-α-syn）が有意に増加した（図2C）。活性化ミクログリアを示す神経炎症マーカーIba1（データは示さず）とアストロサイトーシスを示すGFAPを分析した結果、ロテノンを注射したCPuでは、注射からすでに2週間後に、対側のCPuに比べて免疫反応領域が有意に増加していた（データは示さず）。同様の結果が黒質でも観察された。図2DにGFAPについて示したように、両マーカーのレベルは注射4週間後も上昇したままであった。 図2. ロテノン注射マウスの神経細胞病理。 A:B：ロテノンおよびDMSO注射マウスから採取した終末血漿中の神経フィラメント軽鎖（NFL）レベル（pg/ml血漿）（ベースライン時、注射2週後および4週後）；n＝8-10。C：pSer129-α-シヌクレイン、D：グリア線維酸性タンパク質（GFAP）免疫反応性（IR）面積（ベースライン時、注射後2週および4週におけるロテノンおよびDMSO注射マウスの同腹側および対側黒質における％）；n＝8。A、C、D：二元配置反復分散分析、Bonferroniポストホック検定：*同一動物内の反対側半球と同側半球間の差；#同一半球を比較したときの治療群間の差。B: ベースラインに対する全群を比較するための一元配置ANOVAとBonferronipost hoc検定、群間および時点間の差を評価するための二元配置ANOVAとBonferronipost hoc検定（ベースライン値は除外）。 *時点間の群間差、#ベースラインとの差。*/#p<0.05、***/##p<0.01***/##p<0.001。C/contraは対側、I/ipsiは同側。 要約すると、野生型マウスの尾状核にロテノンを片側注射すると、強い運動障害、ドーパミンシグナル伝達障害、神経変性、神経炎症が起こる。その影響は強固で、主に注入した脳領域で観察されるが、同側の黒質でも観察され、ロテノンを注入した半球の対側の脳領域は影響を受けない。病態はロテノン注射の2～4週間後にはすでに明らかであるため、ロテノン注射マウスは非常に迅速なPDモデルであり、したがって非常に短いリードタイムでPD治療薬の試験が可能である。 この脳内ロテノンマウスモデルを用いた研究を開始するには、今すぐお問い合わせ ください！
ゴーシェ病（GD）の病態生理を研究し、治療戦略を開発するためには、信頼性の高いin vitroモデルが不可欠である。GDに特徴的な特定のリソソーム酵素の欠損による脂質の病的蓄積は、GD患者由来のヒト線維芽細胞（HF）とGDマウスモデル4L/PS-NAのマウス胚性線維芽細胞（MEF）で評価することができる。 これらのin vitroモデルは、初期段階のスクリーニング、化合物のプロファイリング、メカニズム研究に適しています。リード化合物の最適化と前臨床試験をサポートするために、in vitroでの知見をin vivoの4L/PS-NAマウスモデルに移植することが可能であり、バイオマーカーのレベル、組織病理学、組織脂質の蓄積などの確立された測定値を用いて治療効果を評価することができる。 すべてのヒトおよびマウス線維芽細胞株のグルコセレブロシダーゼ（GCase）活性は、健常ヒト線維芽細胞に比べて有意に低下している（図1A）。GD関連基質レベルは、GD患者由来のタイプ1ヒト線維芽細胞で最も高いが（図1B-D）、コンデュリトールβエポキシド（CBE）処理した健常ヒト線維芽細胞および4L/PS-NAマウスのMEFもまた、選択した基質のレベルが有意に増加している（図1B-D）。 図1. 異なるGD患者由来の線維芽細胞、CBEで処理した健常対照細胞、および4L/PS-NAマウスのマウス胚線維芽細胞（MEF）において、GCase活性が有意に低下し、基質蓄積量が増加した。 A:健常対照ヒト線維芽細胞（HF）±CBE、GD患者由来線維芽細胞および4L/PS-NA MEFにおけるGCase活性を、4-MUGベースの活性アッセイを用いて評価した。B-D：上記細胞株の細胞ペレット中のGD関連基質レベルをHPLC-MS/MSで評価。GDタイプI細胞で蓄積した基質のレベルが最も高い。データは相対蛍光単位(RFU; A)またはµgタンパク質あたりのpg脂質で示す。平均値＋SEM（各群n=6反復）。一元配置分散分析（One-way ANOVA）とボンフェローニ・ポストホック検定：*p<0.05; **p<0.01, ***p<0.001。 リソソームを可視化するためにヒトおよびマウスの線維芽細胞をLysoTracker™で染色したところ、GD患者由来の1型ヒト線維芽細胞（図2B、E）および4L/PS-NAマウスのMEF（図2D、E）では、健常ヒト線維芽細胞と比較して有意に強い染色が認められた。 図2. 異なるGD患者由来の線維芽細胞株、4L/PS-NA MEFおよび健常対照細胞における、LysoTracker™を用いたリソソーム染色の代表的な画像、およびそれぞれのシグナルの評価。A-D :GDおよびMEF-4L/PS-NA細胞株では、健常対照と比較してリソソームが拡大し、強く染色されている。GDタイプ1細胞で最も強い染色（B、スケールバー400μM）。E: データは、LysoTracker™画像の健常対照に対して正規化したIntegrated Intensity Object Average / Phase Area Confluenceで示す。平均値＋SEM（各群n=6反復）。一元配置分散分析、Bonferronipost hoctest ***p<0.001。 これらの結果は、線維芽細胞をベースとしたモデルの有用性を支持すると同時に、in vitroモデルの移植性を強調し、ゴーシェ病の病態生理を包括的に理解するためにin vivoモデルを改良する可能性を強調している。 4L/PS-NAマウスの線維芽細胞の他に、GBA D409Vなどの様々なGBA変異を持つゴーシェ病モデルマウスや、ニーマン・ピック病や ポンペ病などの他のライソゾーム貯蔵病モデルマウスのMEFも用いることができる。 したがって、GD患者由来のヒト線維芽細胞と4L/PS-NAマウス由来のMEFは、in vitroゴーシェ病研究のための貴重なモデルであり、in vitroから in vivo研究へのシームレスな移行を可能にする。 線維芽細胞のin vitro試験を開始するには、今すぐご連絡ください ！
加齢と長寿に関する研究は、人間の健康と寿命を延ばす探求においてますます重要な分野となっているため、Scantox ニューロ社は、in vitroおよびin vivoでの加齢研究と、それに続く生化学的および組織学的組織分析を可能にするサービス・ポートフォリオを増やしている。 老化とは、生物における進行性の生理学的変化を指し、時間の経過とともに生物学的機能が低下し、ストレスや病気に対する脆弱性が増大する。老化は、生物の成体期を通じて起こる広範なプロセスである。細胞の老化はしばしば老化と呼ばれる。 加齢はほとんどの神経変性疾患の主な危険因子であるが、それ自体が認知能力や運動能力の低下につながることも多い。これらの障害を生体内でモデル化するために、老化した野生型マウスに次いで、SAMP8マウスがこの分野にとって大きなチャンスとなる。これらの老化促進マウスは、生後4ヶ月という早い段階で、文脈恐怖条件付けテストやワイヤーぶら下がりテストにおける学習障害や運動障害によって、老化に関連した機能低下を示す（図1）。 図1：SAMP8マウスにおける認知機能と運動機能の低下。SAMP8マウスは生後4ヶ月の時点で、文脈的恐怖条件付けテスト（A）における学習障害と、ワイヤーぶら下がりテスト（B）における運動障害を評価した。A：フットショックを受けてから5分間の平均固まる時間。B：ワイヤー掛け時間（秒）。切断時間は300秒。結果は正常老化対照として同年齢のSAMR1マウスと比較した。平均値＋SEM、各群n＝12、不対t検定、*p<0.05; ***p<0.001。 組織学的には、以下のような加齢に関連した病態を評価することができる： 老化マーカーとしてのリポフスチン粒 プルシアンブルー染色による脳の微小出血（図2A） ゴルジ・コックス銀含浸によるスパイン密度（図2B） ダブルコルチンとBrdU染色による神経新生（図2C） …そして、さらに多くのものがすでに利用可能であるか、または確立することができる 図2：微小出血、棘、神経新生の代表的な画像。 A:プルシアンブルー染色で解析した大脳皮質と脳梁の灰白質と白質それぞれの血管漏出。B：歯状回と海馬CA1領域におけるスパイン染色。棘密度は評価者に依存しない方法で測定できる。C：ダブルコルチン陽性ニューロンの標識とBrdU陽性核の染色による海馬歯状回の神経新生。 SAMP8マウスの老化に関連した生化学的測定値としては、以下のようなものがあるが、これらに限定されるものではない： ミトコンドリアマーカーとしてのTOMM20（図3、A） オートファジーのマーカーとしてのp62（図3, B） 老化マーカーとしてのp53 これらの表示に加えて、エージングモデルの評価も可能だ： オートファジーと老化のマーカーとしてのβ-ガラクトシダーゼ活性 老化のマーカーとしてのテロメア長とテロメラーゼ活性 図3：マウスの線条体組織におけるTOMM20とp62の自動ウェスタンブロッティングWESの代表的なレーン図。 2つの異なるマウス群（X群とY群）の線条体組織におけるTOMM20とp62の発現レベルの違い。各群について、3匹のマウスの組織を分析した。STDは標準。 2025年1月のScience Newsで紹介した加齢のin vitroモデルとしての脳オルガノイドに加え、Scantox Neuroはin vivoでの 加齢と老化のモデル化においても豊富な経験を有している。組織は、様々な組織学的および生化学的方法により、老化および老化関連バイオマーカーを評価することができる。 加齢と老化の研究を始めるには、今すぐご連絡ください ！
B6.SOD1-G93A transgenic mice are a highly translational model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) as they display common disease characteristics. Mice exhibit a slightly delayed progression of the ALS phenotype compared to the commonly used SOD1(*G93A)1Gur mice. B6.SOD1-G93A mice are bred on a congenic C57BL/6 background while SOD1(*G93A)1Gur mice are bred on a mixed C57BL/6xSJL background. … Read more
Brain organoids, self-organized three-dimensional aggregates derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC), have emerged as a novel and translational model for studying human brain development and developmental diseases. Brain organoids recapitulate key aspects of human brain structure, including representative cell populations and a complex 3D architecture (Figure 1). Utilizing this complex tool to also … Read more
Looking for something to read for the holidays? In 2024, Scantox Neuro developed various new in vitro and in vivo models and methods, and existing ones were constantly improved. Our currently ongoing and planned R&D projects are now presented in the new R&D corner. The results of Scantox Neuro’s steady R&D efforts lead to 3 … Read more
Accumulation of phosphorylated tau (ptau) protein is a characteristic of tauopathies and many other neurodegenerative diseases. Hyperphosphorylated tau was shown to dissociate from microtubuli, resulting in the breakdown of the axonal flow, and thus impairing neuronal viability and function. Since tau presents a promising drug target, an inducible model of tau phosphorylation provides a quick … Read more
In recent years, gene and cell therapies have revolutionized treatment options for previously incurable diseases. Their thorough testing in preclinical studies using cells, tissues and animals is crucial before they reach the clinics to assess therapeutic effects and potential adverse side effects. Preclinical studies are key to demonstrating efficacy, ensuring successful translation to patients and … Read more
Longitudinal, and thus repeated sampling of cerebrospinal fluid (CSF) from a single animal, combined with repeated measurements of biomarkers, offers a highly translational approach for analyzing progressive pathological changes while minimizing the number of needed animals. The CSF composition reflects biological changes inside the central nervous system and can thus be used to observe pathological … Read more
神経炎症は、中枢神経系に影響を及ぼす神経変性疾患やその他の疾患との闘いにおいて、成長しつつある研究分野である。 我々はすでに、4L/PS-NAマウスが内臓器官や皮質脳領域で強い炎症を示すことを明らかにしている（Schiffer et al.） 4L/PS-NAマウスの小脳は高度に障害された形態を示すことから（Schiffer et al. その結果、18週齢の4L/PS-NAマウスの小脳では、アストロサイトーシスとミクログリオーシスが、それぞれGFAP抗体とIBA1抗体で標識した場合に強く増加していることが示された。 図1. 4L/PS-NAマウスの小脳におけるアストロサイトーシスと活性化ミクログリアの定量化。 4L/PS-NAマウスの小脳について、18週齢におけるアストロサイトーシス（GFAP；A）と活性化ミクログリア（IBA1；B）の免疫反応面積（IR）のパーセントを対照同腹子と比較して解析した。 非対T検定。 各群n = 5。 平均値＋SEM。 ***p<0.001。C：18週齢の4L/PS-NAマウスおよびコントロールマウスにおける小脳のGFAP、IBA1およびDAPI標識の代表的画像。4L/PS-NAマウスモデルでの研究をご希望の方は、今すぐお問い合わせください！
様々な組換えヒトα-シヌクレイン（α-syn）フィブリルの毒性および大脳皮質初代ニューロンへの播種特性をin vitroで評価した。 その結果、単量体ヒトα-synは細胞生存率に影響を及ぼさないが、予め形成された野生型およびA53Tヒトα-syn線維は初代皮質ニューロンに対して毒性作用を有することが示された。 この毒性作用は、オリゴマーアイソフォームによって上回った（図1A）。 試験したアイソタイプのうち、A53T α-syn線維のみが大脳皮質ニューロンへの播種性を示した（図1B）。図1.マウス初代神経細胞におけるα-synプレフォームドフィブリルのin vitro評価。毒性 (A)と播種 (B)マウス初代大脳皮質ニューロンに対する様々な組換えヒトα-syn種（Stressmarq）の特性。 (A）α-syn種で処理し、MTTアッセイで細胞生存率を評価した神経細胞。 (B）α-syn種で処理し、マウスα-synについて免疫細胞化学的に分析したニューロン。 平均値＋SD。 Bonferroni post hoc testを伴う一元配置分散分析（対ビヒクルコントロール：VC）。 ** p<0.01、*** p<0.001。 図2. 異なる組換えヒトα-syn種（Stressmarq）を播種した後の内因性マウスα-syn蓄積の代表的画像. Neurons were treated with (A) monomeric and (B) A53T preformed fibrils and after incubation immunocytochemically stained for murine α-syn. Nuclear stain DAPI = blue; murine α-syn = red; scale bar 100 µM. A53T変異を有するα-シヌクレイン発現マウスin vivoモデル … Read more
