遺伝子組込み型カルシウムインジケータ（GECI）による化合物治療に対する自発神経活動のモニタリング

培養細胞の自発的な神経細胞活動は、神経細胞の健康状態に関連する生理学的に最も関連性の高い読み出し値の一つである。 カルシウム濃度は、神経活動の有能な間接的レポーターとして神経科学で広く用いられている。活動電位（AP）発火は、電位依存性カルシウムチャネルを介した^Ca2+の大量流入を引き起こすからである。

^IncuCyte®NeuroBurst（遺伝子コード化カルシウムインジケータ（GECI））をIncuCyte^®ライブセルイメージングシステムと組み合わせることで、培養細胞内の数千の機能性ニューロンの形態学的変化をモニターし、ニューロン活動を長期間にわたって測定することができる。

神経細胞の自発活動を解析するために、ラットの初代神経細胞をNeuroBurstで形質導入し、DIV8まで培養する。 その後、処理を行う前に、^IncuCyte® ライブセルイメージングシステムで細胞の自発的ベースライン活動を解析する。 細胞は

• PicrotoxinはGABA受容体クロライドチャネルの非競合的チャネル遮断薬であり、神経細胞を刺激し、発作を誘発することが報告されている。
• MK-801はNMDA拮抗薬で、抗けいれん薬として作用し、神経細胞の活動を抑制する。
• フォルスコリンは、cAMP上昇剤であり、神経細胞の分化、健康、および活性を増加させることが記載されている。

処理後6、12、24、48、72時間後に、^IncuCyte®ライブセルイメージングシステムを用いて細胞の反応を再度モニターする。

3つの項目はすべて、それぞれのビヒクルコントロール（VC）と比較して期待される結果を示した。 MK-801処理は、その抗興奮活性を反映して活性ニューロンの減少をもたらすが、ピクロトキシンとフォルスコリンは活性ニューロン数を増加させる（図1A）。 フォルスコリンはさらに、投与開始から72時間後までのバースト率に影響を与え（図1B）、ピクロトキシンは神経細胞活動の相関性と同期性に強く速い影響を示した（図1C）。

図1：^IncuCyte® NeuroBurstを用いた、治療に対する神経細胞活動の経時的モニタリング。 A：ウェルあたりの活性神経細胞数（記録時間あたり少なくとも1回バーストした対象）、B：1分あたりのバースト総数として示したバースト率、C：神経細胞活動の相関性を、すべての対象物の平均値として示したもの（0は完全にランダム、1は高度に同期している）。 データは、統合された^IncuCyte® Neuronal Activity Analysis Software Moduleにより作成された。

ビデオ96ウェルマイクロプレートに30,000cells/wellで播種したラット初代皮質ニューロンを^IncuCyte® NeuroBurst Orange試薬に感染させ、ニューロン活動を徐々にモニターした。 DIV10（処理開始から48時間後；ピクロトキシン、フォルスコリン、MK801またはビヒクルコントロール（VC）による処理）に撮影した動画は、異なる処理による自発的な神経細胞活動（カルシウム振動）の変化を示している。

したがって、ラットの一次ニューロンを使用して、自発的なニューロン活動を評価することができる。 参照化合物として、ピクロトキシン、MK-801、フォルスコリンを用いることができる。