2006年、Neumannらにより、ヒト筋萎縮性側索硬化症(ALS)の脳サンプルにおいて、RNA結合タンパク質TDP-43の凝集体と局在異常が発見された。 それ以来、in vitro およびinvivoでの TDP-43の過剰発現がALSの病態を引き起こすことが示され、ALSの根本的なメカニズムを研究するのに適したモデルとなった。 しかし、トランスジェニックALSモデルマウスでは、病態は急速に進行し、致死的である。 そこで我々は、ヒトTDP-43(hTDP-43)を発現する血清型9型アデノ随伴ウイルス(AAV9)を成体C57Bl6マウスの運動皮質に注射することにより、進行が緩やかな誘導性ALSモデルマウスを樹立した。 hTDP-43 mRNAおよびタンパク質の恒常的発現は、RT-qPCR法および組織学的手法で評価したところ、注入後3、6、9ヶ月で確認された(図1A、B)。 より詳細には、四重免疫蛍光標識により、大脳皮質のCTIP2陽性ニューロンを含むほぼ神経細胞のみが形質導入され、GFAP陽性アストロサイトはTDP-43陰性であることが明らかになった(図1C)。 図1:AAV-hTDP-43注射マウスにおけるhTDP-43 mRNAとタンパク質の発現プロファイル。 hTDP-43 mRNAのレベル (A)とタンパク質 (AAV-hTDP-43対AAV-emptyコントロール注射後の運動皮質における(B)。 AAV-hTDP-43を注射した動物の運動皮質におけるhTDP-43(緑)、GFAP(青緑)、CTIP2(白)、NeuN(赤)、DAPI(青)の代表的な5チャンネル画像と、同じマーカー(白)の1チャンネル画像。 hTDP-43シグナルは、CTIP2陽性細胞(緑の矢印の頭)を含むNeuNと共局在するが、GFAP陽性アストロサイト(黄色の矢印)とは共局在せず、hTDP-43の純粋な神経細胞発現を示している(矢印の頭)。 二元配置分散分析(Two-way ANOVA)とボンフェローニのポストホック検定。 平均値±SEM。 **p<0.01; ***p<0.001。 各群n = 8。 AAV-hTDP-43の注入はさらに、定量的免疫蛍光画像解析を用いて、注入後3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月のGFAPシグナルの強い増加をもたらした(図2A)。 GFAPシグナルの詳細な評価では、GFAP陽性細胞の数が増加し、これらの細胞は対照群の細胞と比較して細胞あたりより大きく、より多くのGFAPを発現していた(データは示さず、詳細はお問い合わせください)。 これらの結果は、アストロサイトの総数が増加し、TDP-43の発現によりそのようなアストロサイトが活性化され、注射後9ヶ月経過しても安定していることを示している。 さらに、運動皮質の面積は、AAV-hTDP-43を注射した動物では、注射後6ヶ月および9ヶ月の対照動物と比較して有意に小さかった;この効果の傾向は、AAV-hTDP-43の適用後3ヶ月ですでに見られた(図2B)。 図2:AAV-hTDP-43注射マウスにおける運動野のアストログリオーシスと萎縮。 GFAP免疫反応(IR)領域の定量化 (A)と領域サイズ (AAV-hTDP-43とAAV-emptyコントロールの注入3、6、9ヵ月後の運動皮質領域(B)。 二元配置分散分析(Two-way ANOVA)とボンフェローニのポストホック検定。 平均値±SEM。 *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。 各群n = 8。 結論として、我々は、成体C57Bl6マウスの運動皮質にAAV-hTDP-43を注射することにより、新たな誘導性hTDP-43モデルを確立した。 ウイルスを注入した結果、神経細胞のみにhTDP-43が導入され、アストログリオーシスによって観察される神経炎症と運動皮質の萎縮が観察された。 その結果、このモデルは基礎研究だけでなく、薬剤開発研究にも使用することができる。AAV-hTDP-43注入マウスを用いたALS研究をご希望の方は、今すぐ弊社までご連絡ください。
中枢神経系における複雑な免疫反応である神経炎症は、神経学的健康の盾であると同時に剣でもある。 神経炎症には、ミクログリアやアストロサイトなどの免疫細胞の活性化、シグナル伝達分子の放出、病原体の貪食などが関与している。 脅威に対する最前線の防御として機能する一方で、調節不全はアルツハイマー病やパーキンソン病、多発性硬化症などの神経疾患の進行に拍車をかける可能性がある。 Scantox Neuroでは、様々な細胞系、プロトコル、アッセイにおいて治療薬の有効性を評価するために、トランスレーショナルな関連性の高い高度なin vitroモデルを提供しています。 人工多能性幹細胞(iPSC)の分野が進歩するにつれ、我々は常にプロトコルを改良している。 不死化細胞株とげっ歯類の初代細胞に関する専門知識を活用し、我々は現在、iPSC由来のヒトミクログリアにおけるリポ多糖(LPS)誘発性サイトカイン放出とAβ貪食アッセイを確立した。 分化したiPSC由来のヒトマイクログリアをLPSと24時間インキュベートすると、関連サイトカインの分泌が有意に増加するが、これはデキサメタゾン(Dexa;図1)のような参考品で逆転させることができ、抗炎症薬の迅速かつ再現性のあるスクリーニングツールとなる。 図1:LPS刺激iPSC由来ミクログリアにおけるサイトカイン放出の増加は、デキサメタゾン処理で回復する。 24時間刺激後、上清を回収し、IL-8、IL-6、TNF-αの3つのサイトカインについて分析した。 データはpg/mL上清として示した。 平均値+SEM、各群n=4-7。 Bonferroni post hoc testを用いた一元配置分散分析。 *p<0.05; **p<0.01。 Dexa、デキサメタゾン;LPS、リポ多糖;VC、ビヒクルコントロール。 同じ細胞を用いて、貪食調節剤を評価することもできる。 pH感受性のpHrodo™ Red標識と結合した組換えAβ1-42をiPSC由来のミクログリア細胞に添加すると、IncuCyte® Livecellイメージング・システムで赤色蛍光の増加として測定可能な取り込みとリソソーム分解をモニターすることができる(図2)。 図2:LPS処理iPSC由来ヒトミクログリアにおけるAβ1-42貪食能の評価。 pHrodo™Red標識Aβ1-42とIncuCyte® Livecellイメージングを用いて、Aβ1-42貪食を20時間測定した。 n=6/群。 平均値±SEM。 二元配置分散分析(Bonferroniのpost hoc検定付き)。 LPSおよびVC処理したiPSC由来ヒトミクログリアの代表的な動画を右側に示す。 Dexaはデキサメタゾン、LPSはリポ多糖、VCはビヒクルコントロール。 NIHとの共同プロジェクトにおいて、この方法はすでにAβ1-42クリアランスに対するヒドロキシクロロキンの効果を評価するために用いられ、成功を収めている(Varma et al.(Varmaら、2023)。 iPSC由来ミクログリアのin vitro試験をご希望の方は、今すぐ弊社までご連絡ください。
2つの異なる濃度のロテノンを野生型マウスの右線条体に直接注射すると、同じ動物の同側およびDMSOを注射した同腹子の対側と比較して、梁歩行試験における対側の滑りが有意に増加した(図1A)。 この表現型は、高用量ロテノンによる病変後少なくとも4週間は測定可能である(図1B)。 図1:10mm角の梁を横切る際の梁歩行試験における同側(I)と対側(C)のスリップ回数 1 (A)および4 (B)週後。 平均値+SEM。 n=3-6. 二元配置分散分析(Two-way ANOVA)後、Bonferroniのpost hoc 検定;*対側コントロール注射と比較;#DMSO注射と比較。 **p> 0.01、*p> 0.05。 さらに、片側ロテノン注射脳の組織学的評価では、投与4週間後に黒質(SN)の神経変性が観察され、ドーパミン作動性ニューロンのチロシン水酸化酵素(TH)シグナルが減少していた(図2)。 加えて、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)とイオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba-1)のレベルが上昇しており、それぞれアストロ・グリオーシスとミクログリオーシスを示唆している(図2)。 図2:高用量ロテノン注射28日後の同側および対側の黒質(SN)におけるTH、Iba1およびGFAP標識の代表的画像。 ロテノンはミトコンドリア複合体Iを阻害する天然農薬であり、炎症を誘発し、黒質ドパミン作動性細胞を選択的に破壊することがすでに示されている。 この脳内ロテノンモデルで観察された運動障害、ドパミン作動性ニューロンの選択的喪失、黒質経路における神経炎症は、ヒトのパーキンソン病の表現型を忠実に再現しており、このモデルはこの壊滅的な疾患の病理学的メカニズムを研究するための貴重なツールとなっている。ロテノンを注射したマウスを用いたin vivo研究をご希望の方は、今すぐお問い合わせください。 その他のin vitroおよびin vivoトランスジェニックおよび誘導パーキンソン病モデルもご覧ください。
B6.SOD1G93Aトランスジェニックマウスは、コンジェニックC57BL/6バックグラウンドで育種され、一般的に使用されているSOD1(*G93A)1Gurマウスに代わる説得力のあるマウスである。 このマウスは、従来C57BL/6xSJLの混血で飼育されていたオリジナル系統と比較して、筋萎縮性側索硬化症(ALS)特異的表現型の進行がわずかに遅い。 ALSの病勢が緩徐であるため、治療的介入の可能性が広がり、新たな治療戦略につながる可能性がある。 B6.SOD1G93Aマウスの筋電図(EMG)評価では、ntg同腹子と比較して、複合筋活動電位(CMAP;図1A)と運動単位活動電位(MUAP;図1B)が持続的に低下していることが明らかになった。 筋電図観察と一致して、B6.SOD1G93Aマウスは、握力試験(図1C)およびワイヤー掛け試験(図1D)の成績低下で明らかなように、筋力の進行性低下を示した。 図1:縦方向の筋電図記録と筋力分析。 CMAPによる筋電図記録 (A)とMUAP (B)の測定。 握力テストにおける前肢最大筋力の分析による筋力測定。 (C)およびワイヤーハンギングテストにおけるハンギングタイム (D). すべての解析は、B6.SOD1G93Aマウスをntg同腹子と比較し、8週齢、14週齢、20週齢で行った。 遺伝子型を主因子とした二元配置分散分析、Bonferroniのポストホック検定。 平均値±SEM。 *p<0.05; ***p<0.001。 n=16/群。 さらに、B6.SOD1G93Aマウスは、血漿中ニューロフィラメント軽鎖(NF-L)レベルの上昇(図2A)によって示されるように、14週齢で明らかな神経変性を示し、時間の経過とともに徐々に悪化し、20週齢で顕著な神経変性に至った。 さらに、オートファジーマーカーp62レベルは、脊髄の頸部、胸部、腰部において20週齢で増加している。 図2:B6SJL.SOD1-G93Aマウスにおける神経細胞の消失とオートファジー。 A:8週齢、14週齢、20週齢のB6.SOD1G93Aマウスの血漿中NF-Lの定量をntg同腹子と比較。 B:20週齢のB6.SOD1G93Aマウスとntg同腹子の頚髄、胸髄、腰髄におけるオートファジーマーカーp62の定量を曲線下面積(AUC)で評価。 A-D:二元配置分散分析(Two-way ANOVA)とBonferronipost hoctest。 平均値+SEM。 n=4-8/群。 *p<0.05; **p<0.01 ***p<0.001。 B6.SOD1G93Aマウスで観察された進行性の運動障害と神経変性は、ヒトのALSの表現型を再現しており、このマウスはALSの病態メカニズムの根底にあるものを調べるための貴重なモデルである。 観察された進行の遅さは、薬理学的介入に有利なウインドウの延長をもたらす。 行動学的評価に加え、反復筋電図評価やin vivo血漿サンプルのNF-L分析などの縦断的指標を追加することで、ALSと闘うことを目的とした薬剤候補をより微妙で高感度に評価することが可能になる。 B6.SOD1G93Aマウスを用いたin vivo試験の開始については、今すぐお問い合わせください。
以前のニュースレターで、我々はすでにAAV2 hA53T-α-synマウスモデルを紹介し、コントロールベクターを注射した対側半球と比較して、片側からウイルスを注射した同じ半球の黒質および尾状被蓋におけるhA53T-α-synレベルの増加を示した。 さらに、このモデルの黒質では、チロシン水酸化酵素(TH)レベルの低下とIba1レベルの上昇を示すことができた。 これらの最初の解析から、AAV2 hA53T-α-synを注射したマウスはパーキンソン病に関連したhA53T-α-syn表現型を示し、ドーパミン作動性病態とミクログリオーシスを伴うことが示唆された。 我々は今回、対照半球と比較したAAV2 hA53T-α-syn注射マウスの黒質における浸潤細胞について、このモデルをより詳細に評価した。 その結果、AAV2 hA53T-α-synを注射した半球では、白血球共通抗原CD45の物体密度(図1A)、CD3標識による浸潤T細胞(図1B)、CD8標識による浸潤細胞傷害性T細胞(図1C)が有意に増加した。 図1:AAV2-A53T-α-synおよびコントロール注射した半球の 黒質におけるCD45、CD3、CD8の定量。 マウス1匹につき4つの脳切片を分析した。 n = 8. Wilcoxon matched-pairs signed rank test (A and C);対t検定 (B). 平均値±SEM。 *p<0.05; ***p<0.001。 D:コントロールベクターまたはAAV2-A53T-α-synを注射し、チロシン水酸化酵素(TH)、CD8、CD45(左)またはチロシン水酸化酵素(TH)、CD8、CD3に対する抗体で標識した黒質の代表的な画像。 いずれの標識もDAPIで核を対比染色した。 SN:黒質。 さらに、AAV2 hA53T-α-synを注射した半球では、黒質(図2A)と尾状被蓋(図2B)のマロンジアルデヒド(MDA)レベルの上昇によって示されるように、酸化ストレスが観察された。 図2:AAV2-A53Tと対照を注射した半球の黒質と尾状被蓋におけるマロンジアルデヒド(MDA)の定量。 マウス1匹につき5つの脳切片を分析した。 n = 8. 一対t検定 (A), Wilcoxon matched-pairs signed rank test (B). 平均値±SEMおよび個々の動物の平均値。 *p<0.05; ***p<0.001。 このように、AAV2-hA53T-α-syn誘導マウスモデルは、発症の早さ、ドーパミン作動系の障害、強い神経炎症、酸化ストレスの増加を特徴としている。 これらの病態のいくつかは、AAV2-A53T-α-synを注射した黒質でのみ 測定可能であるが、A53T-α-synタンパク質の発現と酸化ストレスは、同じ半球の尾状被蓋でも増加しており、局所的なAAV2-hA53T-α-syn注射の全身的な影響を示している。 AAV2-hA53T-α-syn誘導マウスモデルでの研究を開始するには、今すぐお問い合わせください!
我々は、様々なライソゾーム貯蔵病(LSD)のモデルとして、患者由来の様々な線維芽細胞を樹立したばかりであり、薬剤スクリーニングのための貴重なツールを提供するものである。 LSDは希少な遺伝性疾患群であり、通常リソソーム分解プロセスを促進する特定の酵素の欠損を特徴とし、リソソーム内に未分解の物質が蓄積する。 これらの疾患は、身体および認知機能に重大な障害をもたらし、発達遅延、臓器機能障害、寿命短縮を引き起こす。 LSDのなかには、乳幼児期や小児期にすでに発症し、急速に健康状態を悪化させるものもある。 われわれは現在、ゴーシェ病、ポンペ病、ニーマン・ピック病患者由来の線維芽細胞の特徴を明らかにし、患者由来細胞と健常対照細胞との病理学的差異を分析することに着手している。 4MUGアッセイによる酵素活性と、ライソゾームの形態とサイズの変化を、総ライソトラッカーシグナルとして解析し、ライソトラッカーシグナルの増加は、形態の変化によるライソゾームサイズの増加を示すと評価した。 ゴーシェ病患者の線維芽細胞におけるβ-グルコセレブロシダーゼ(GCase)活性およびポンペ病患者の線維芽細胞におけるα-グルコシダーゼ(GAA)活性を健常対照と比較して評価した結果、疾患線維芽細胞の酵素活性に顕著な障害があることが明らかになった。 ゴーシェ病、ポンペ病、ニーマン・ピック病(NPC)患者由来の線維芽細胞のライソトラッカーイメージングでは、健常細胞と比較してリソソームの形態に有意な違いがあることがさらに強調された。 ゴーシェ患者由来の線維芽細胞は、ライソトラッカー染色により、GCase活性が強く低下していることが確認され、健常細胞と比較してシグナルが増加していることから、健常対照と比較してリソソームが拡大していることが示された(図1)。 図 1: ゴーシェ病:(A)ゴーシェ病患者由来および健常人由来の線維芽細胞のβ-グルコセレブロシダーゼ(GCase)活性を4MUGアッセイで評価し、相対蛍光単位(RFU)として表示した。 (B)ライソトラッカーシグナルは健常対照に対するパーセントで表示した。 一元配置分散分析(One-way ANOVA)とダネットの多重比較検定。 ***p<0.001。 同様に、ポンペ患者由来細胞はGAA活性が著しく低下しており、ライソトラッカー染色では健常細胞と比較してシグナルが有意に増加していた(図2)。 図 2: ポンペ病: (A)ポンペ病患者由来および健常人由来の線維芽細胞のα-グルコシダーゼ(GAA)活性を4MUGアッセイで評価し、相対蛍光単位(RFU)として表示した。 (B)ライソトラッカーシグナルは健常対照に対するパーセントで表示。 対応のないt検定。 ***p<0.001。 ニーマン・ピック病(NP)患者由来の2つの異なる線維芽細胞株は、ライソトラッカーを12時間培養した後、健常対照と比較して有意に高いリソソーム数を示した(図3)。 図 3 ニーマン・ピック病:2つの異なるニーマン・ピック病C型患者由来線維芽細胞のライソトラッカーシグナルを健常対照に対するパーセンテージで表示。 対応のないt検定。 **p<0.01; ***p<0.001。 これらの知見は、LSD患者由来の線維芽細胞が、疾患の特徴をリアルに模倣していることから、薬剤試験のための強固なツールとしての可能性を強調するものである。 これらの細胞株は、4L/PS-NA マウス、GBA D409V KIマウス、NPC1-/-マウス、6neoマウスなど、それぞれゴーシェ病、ニーマン・ピックC1病、ポンペ病をモデル化したマウスモデルの補完的なツールとして使用することができる。 現在進行中の研究としては、クラッベ病やファブリー病などの他のLSDを構成する様々なLSD線維芽細胞株の広範な特性解析がある。 この研究は、LSDの理解を深めることに貢献し、標的を絞った治療的介入の開発につながることが期待されます。患者由来線維芽細胞の研究を開始するには、今すぐご連絡ください!
我々は現在、モリス水迷路(MWM)テスト中に収集されたデータの高度な検索戦略分析を、確立されたプロトコルを変更することなく提供している。 MWMは、数十年前から空間ナビゲーションと学習を分析する方法として広く認知されている。 このため、認知障害を持つげっ歯類モデルの評価には貴重なツールであり、例えば、以下のような研究に用いられている。 g. アルツハイマー病などの研究に用いられる。 MWMの従来の読み出し値は、隠れたプラットフォームを見つけるまでの待ち時間や移動距離のようなもので、複雑な行動の違いを捉えるようには設計されていない。 この貴重なテストを最適に利用するために、我々は、以前に発表され、査読を受けたアルゴリズム(Cooke et al.、2020&Curdt et al.、2022)に基づいて、通過した経路を異なる探索戦略に分類し、認知スコア(図1A)と関連付ける追加分析方法を確立した。 この追加情報は、認知障害をさらに明らかにすることができ、従来の分析方法よりも感度が高いことが証明されている(図1 A vs. B, C)。 認知スコアは、トレーニング試行間の学習進捗を評価するための貴重な初期指標となり得る。 図1:戦略分析の認知スコアと従来分析の脱出潜時との比較。 5xFADマウスと非トランスジェニック(ntg)同腹動物における訓練1-4日目およびプローブ試行(PT)中の空間学習の評価。 (A)探索戦略の分類と評定。スコアが高いほど、より空間記憶に依存した戦略を使用していることを示す。 (B-C) 従来のMWM分析では、訓練中の逃避までの待ち時間とプローブ試行(PT)中のターゲットゾーン横断を評価した。 二元配置分散分析(Two-way ANOVA)およびボンフェローニの多重比較ポストホック 検定(A、 B);マン・ホイットニー検定 (C); 平均値±SEM; 各群n=24; 男女混合; *p<0.05, **p<0.01。 認知スコアに加え、探索戦略分析は、各トレーニング日とプローブ試行(PT)で使用された異なる戦略を描くことにより、空間学習のニュアンスをさらに解明するためのわかりやすいグラフを提供することができる。 より空間学習的で海馬依存的な方略を青色で強調し、記憶依存性の低い方略を赤色で示すことで、経時的な進歩を魅力的に視覚化することができる。 統計解析のために、各日における海馬依存的戦略と海馬非依存的戦略の量を、非トランスジェニック(ntg)同胞と比較することができる(図2A)。 従来の解析アプローチの読み出しと比較して、この評価は既存のデータに大きな価値を加える。 図2:従来の解析手法の移動距離とThigmotaxis指標と比較した戦略概要。 5xFADマウスとntg同腹子の訓練1-4日目およびPTにおける空間学習の評価。 (A)1日あたりに使用された戦略の割合の棒グラフ。 赤は海馬に依存しない探索戦略、青は海馬に依存する探索戦略。 統計解析は、5xFADマウスとntg同腹子の1日あたりの依存的探索戦略と独立的探索戦略の割合を比較することで行った。 (B)従来の解析の移動距離とThigmotaxis。 二元配置分散分析およびBonferroniの多重比較ポストホック 検定;平均値±SEM;各群n = 24;雌雄混合; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。モリス水迷路試験のこの新しい検索戦略分析法を用いた動物実験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
私たちは現在、運動障害を持つげっ歯類モデルにおいて、in vivo筋電図測定を縦断的に繰り返し行うことができます。 これらの分析により、動物の環境や感情の状態に影響されない、薬剤候補に関する高感度な経時的測定値が得られます。 代表的な測定値は、複合筋活動電位(CMAP)、運動単位活動電位(MUAP)、運動単位数推定(MUNE)です。 筋萎縮性側索硬化症モデルとしてC57BL/6JバックグラウンドのSOD1-G93Aマウス(SOD1-B6)のCMAP最大振幅を経時的に評価した結果、非トランスジェニック(ntg)動物の振幅は経時的に変化しなかったのに対し、SOD1-B6マウスのCMAP最大振幅は漸減した。 SOD1-B6マウスのCMAP振幅はすべての時点でntgマウスに比べて有意に減少した(図1A)。 ピークまでのCMAP潜時を評価すると、SOD1-B6マウスでは徐々に値が増加した。 SOD1-B6マウスとntgマウスとの差は14週目から有意になった(図1B)。 図1:麻酔をかけたSOD1-B6マウスにおける縦方向のCMAP測定。 CMAP振幅の縦断的測定(単位:mV (A)と縦断的CMAPピーク潜時(ms) (8週齢、14週齢、20週齢のSOD1-B6マウスとntg同腹子のCMAP振幅(mV)およびピークまでのCMAP潜時(ms)の縦断的測定(B)。 二元配置分散分析、Bonferroniの多重比較ポストホック 検定;平均値±SEM;各群n = 16;男女混合;***p<0.01、***p<0.001。 ntg、非トランスジェニック。 神経筋接合部の疲労効果を調べるために刺激を繰り返した結果、SOD1-B6マウスではすべての時点でntg同腹子と比較して有意に振幅が減少した。 その差は時間の経過とともに有意に変化することはなかった(図2A)。 SOD1-B6マウスの運動単位活動電位(MUAP)を縦断的に評価した結果、SOD1-B6ではすべての時点でntg同腹子と比較して有意に振幅が減少した。 その差は時間とともに変化しなかった(図2B)。 図2:麻酔をかけたSOD1-B6マウスにおける反復(rep.)刺激とMUAP、測定後の縦方向の振幅変化。 繰り返し刺激後の振幅変化(パーセント (A)およびMUAP振幅の縦断的測定(mV) (8週齢、14週齢、20週齢のSOD1-B6マウスとntg同腹子のMUAP振幅の縦断的測定(B)。 二元配置分散分析(Two-way ANOVA)後、Bonferroniの多重比較ポストホック 検定;平均値±SEM;各群n = 16;男女混合; *p<0.05、***p<0.001。 ntg、非トランスジェニック。 反復筋電図測定による動物の検査については、今すぐお問い合わせください!
GCase活性の低下は、ゴーシェ病の主要な特徴である。 乾燥血液スポット(DBS)として採取した少量の全血から、複数の時点におけるGCase活性の変化をモニターすることにより、薬効に関する貴重な新しい知見を得ることができる。 ヒトグルコシルセラミダーゼβ(GBA)遺伝子の変異とそれに伴うGCase活性は、ゴーシェ病(GD)の原因である。 ゴーシェ病におけるグルコシルセラミダーゼβ(GBA)遺伝子の変異とそれに伴うGCase活性は、ゴーシェ病の原因遺伝子である。 薬剤候補のスクリーニングや、前臨床モデルにおける酵素置換療法や遺伝子治療アプローチの試験のためのトランスレーショナルリードアウトは常に開発され、改良されている。 GCase活性の評価を含むDBS分析は、患者におけるGDの診断とモニタリングのためのゴールドスタンダードとなっている。 DBSは、必要な全血量が最小限であること、保存が容易であること、持ち運びが可能であることなどから、臨床応用に実用的なソリューションを提供する。 同じ利点が動物実験にも当てはまります。しかし、さらに少量の血液を扱う場合には課題が生じ、一貫した再現性のある結果を得ることが難しくなります。 SCANTOXでは、最小限の全血を用い、DBSサンプルを用いた4-MUGベースのGCase活性測定法を最適化しました。 このアプローチにより、マウスの複数のin vivoサンプリングから得られた血液を利用し、GCase活性を漸進的にモニターすることが可能となり、単一のエンドポイント測定に依存することがなくなりました。 以下のデータは、脳内で評価されたGCase活性の比較分析である。 (A)とDBSサンプル (B) 4ヶ月齢のGBA D409V KIマウスに由来し、これらの測定値が一致することを強調している。 ホモ接合体(tm/tm)、ヘテロ接合体(tm/wt)、野生型(wt/wt)の同腹子の脳とDBSサンプルを分析したところ、どちらのサンプルタイプでも遺伝子投与量に依存したGCase活性の低下が明らかになった(図1参照)。 図1:GBAD409V KIマウスの脳とDBSにおけるGCase活性。 4ヶ月齢のホモ接合体(tm/tm)、ヘテロ接合体(tm/wt)、野生型(wt/wt)の同腹子の脳とDBSサンプルを、4-MUGベースのアッセイを用いて分析した。 一元配置分散分析、Bonferroniの多重比較ポストホック 検定;平均値+SEM;各群n = 6;**p<0.01、***p<0.001。 tm、標的変異。ゴーシェ病研究の開始については、今すぐお問い合わせください!
MPTPをマウスの腹腔内に繰り返し注射すると、ドーパミン作動性ニューロンの変性と神経炎症として示されるパーキンソン病の脳病理が生じる。 脳内に入ると、メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)は酸化されて神経毒性の高い化合物1-メチル-4-フェニルピリジニウム(MPP+)となり、ドーパミン作動性ニューロンに選択的に取り込まれる。 ニューロン内部では、MPP+がミトコンドリア機能を破壊し、酸化ストレスを引き起こし、最終的にニューロンを死に至らしめる。 MPTP反復注射の効果は、尾状被蓋におけるチロシン水酸化酵素(TH)レベルの測定によって組織学的に検証することができる(図1A)。 並行して、活性化ミクログリアのマーカーであるIba-1と活性化アストロサイトのマーカーであるGFAPが上昇し、神経炎症を示している(図1B、C)。 図1:尾状被蓋に対するMPTP反復腹腔内注射の影響。 野生型マウスにMPTPを5日間繰り返し注射し、チロシン水酸化酵素(TH、 A)、Iba-1 (B)、GFAP (C)免疫反応性(IR)領域を解析した。 対照として、車両で処理した野生型同腹子を用いた。 対応のないt検定(A、 B)およびMann-Whitney U検定 (C); mean + SEM; n = 8 per group; *p<0.05, ***p<0.001。 MPP+はドーパミン・トランスポーターによって尾状核のドーパミン作動性終末に取り込まれ、最初に損傷を与えるが、黒質のドーパミン作動性細胞体節は無傷のままである。 後者は、繰り返しMPTPを投与したマウスの黒質におけるTHとIba-1のレベルが変化していないことを示す結果(図2A, B)により確認され、神経細胞の損傷がないことを示す一方、GFAPレベルは上昇しており、進行中の炎症プロセスを示している(図2C)。 図2:黒質に対するMPTP反復腹腔内注射の影響。 野生型マウスにMPTPを5日間反復注射し、線条体のチロシン水酸化酵素(TH、 A)、Iba-1 (B)、GFAP (C). 対照として、車両で処理した野生型同腹子を用いた。 対応のないt検定;平均+SEM;各群n=8;*p<0.05。 MPTP反復投与による脳の病態の評価は、生化学的手法を用いてさらに評価することができる。我々の結果は、MPTPの反復腹腔内注射がパーキンソン病を正確にモデル化することを示している。 マウスの脳で観察されたプロセスとその結果生じた病理は、典型的なパーキンソン病の病理に酷似している。 従って、今回発表された反復MPTPモデルは、この疾患のメカニズムを理解し、薬剤候補を試験するための貴重なツールである。 このin vivoモデルと並行して、一次皮質または海馬ニューロンをMPP+で処理するin vitroMPP+モデルも確立されており、試験化合物の評価に使用する準備が整っています。MPTP試験を開始するには、今すぐお問い合わせください!
我々の研究開発チームの最新の結果は、トランスジェニックPS19マウスにおいて、幼少期からすでに総タウ量とリン酸化タウ(ptau)量が非常に増加していることを示している。 このネズミのタウオパチーモデルは、ネズミのプリオンプロモーター(Prnp)の制御下で、P301S変異を持つタウ蛋白質のT34アイソフォームと4微小管結合反復(1N4R)を発現している。 これまでのところ、生後6ヶ月の動物でプタウレベルが上昇していることが発表されている。 我々は今回、PS19マウスが生後2.5ヶ月ですでに総 ptau231レベルが非常に増加していることを示すデータを発表した。 2.5、4.5、6.5、8ヶ月齢のPS19マウスの大脳皮質を分析したところ、可溶性皮質画分中の総タウレベルとptau231レベルが非トランスジェニック(ntg)同腹子と比較して非常に増加していた(図1A、B)。 PS19マウスの総タウ濃度は年齢とともに有意に増加したが(図1A)、ptau231濃度はすべての年齢群ですでに高度に増加しており、年齢による変化はなかった(図1B)。 PS19マウスの不溶性皮質画分を評価したところ、可溶性画分で観察されたのと同様の結果が得られたが(図1C、D)、PS19マウスの不溶性皮質画分中の総タウ濃度は年齢とともに減少した(図1C)。 図1:2.5、4.5、6.5、8ヵ月齢のPS19マウスとntgマウスの可溶性および不溶性皮質画分中の総タウおよびptau231レベル。 Triton X-100可溶性画分および不溶性画分中の総タウおよびptau231の免疫吸着アッセイ。 二元配置分散分析、Tukeyの多重比較ポストホック検定。 平均値+SEM; n = 8 / 群; *p<0.05; ***p<0.001。 2.5ヶ月、4.5ヶ月、6.5ヶ月、8ヶ月齢のPS19マウスの可溶性海馬画分を評価したところ、8ヶ月齢でntg同腹子や若いPS19マウスと比較して総タウとptau231レベルが非常に増加した(図2A、B)。 不溶性海馬画分中の総タウを解析したところ、可溶性画分で観察されたのと同様の結果が得られた(図2C)。 不溶性海馬分画中のptau231レベルは、ntg同腹子と比較して2ヵ月半の時点ですでに有意に増加していた。 さらに、この不溶性画分では、海馬のptau231レベルは年齢とともにさらに増加した(図2D)。 図2:2.5、4.5、6.5、8ヵ月齢のPS19マウスとntgマウスの可溶性および不溶性海馬画分中の総タウおよびptau231レベル。 Triton X-100可溶性画分および不溶性画分中の総タウおよびptau231の免疫吸着アッセイ。 二元配置分散分析、Tukeyの多重比較ポストホック検定。 平均値+SEM; n = 8 / 群; **p<0.01; ***p<0.001。総タウ、ptau231、ptau181レベルの上昇を示した我々の以前の予備的結果と合わせて、我々の新たな結果は、タウオパチーのモデルとしてのPS19マウスの病理学的進行に関する洞察を提供するものである。 これらの結果は、PS19マウスがタウオパチーやタウのリン酸化を研究し、タウ関連疾患を改善するための新規化合物の有効性を試験するための貴重なツールであることをさらに促進するものである。 PS19マウスの病理学的変化に関するさらなる結果は現在評価中であり、間もなく発表される予定である。 このタウオパチーモデルマウスの詳細については、続報をお待ちください!PS19マウスを用いた研究をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
脳梁注射は、細胞や様々な薬剤の投与経路として、髄腔内注射と比較してマウスやラットのより吻側脳領域への分布を確実にするために最も好ましい。 さらに、様々なトレーサー分子をマグナ房に注射することで、げっ歯類のリンパ系を通る脳脊髄液(CSF)の動きを追跡することができる。 最近発見されたこの経路は、毒性代謝溶質のクリアランスに関与していることが示されている。 この経路は、末梢治療と比較して、血液脳関門を通過する多くの薬剤の透過性をさらに高めるので、CSFに直接化合物を注射するのに有利である。 硬膜を通しての注入物質の漏れを最小限にするために、我々は様々な既知の技術を組み合わせた結果、げっ歯類では最小限の物質損失しか生じなかった。図1. ハミルトン注射器を用いたネズミの脳脊髄注入の模式図。注入後、髄液サンプリングは反復的または終期的に行うことができる。 注入に先立ち、動物はイソフルラン吸入により麻酔される。 麻酔後、動物を脳定位固定装置に入れ、後頭骨下の切開部位を剃毛と消毒により準備する。 脊髄だけでなく血管への損傷を防ぐため、また髄液の損失や汚染を最小限にするため、ハミルトン注射器を特定の角度に設置する。 注入側の適切な治癒後、髄液採取は、生体内採取で繰り返し行うか、組織採取で終末的に行うことができる。 髄液は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ライソゾーム貯蔵病などの神経変性疾患の発症および進行中に起こる生化学的変化を反映する薬力学的および予後バイオマーカーの貴重な供給源である。 髄液採取は、血液の混入のない純粋な髄液を採取する100%までの効率で行われる。 髄液注入は遺伝子治療研究にも関連するかもしれない。この方法によって前臨床in vivo研究のリードアウトをどのように改善できるか、今すぐご相談ください!