神経変性疾患研究におけるバイオマーカーとその使用は、研究の新分野を画定し、前臨床疾患モデルと患者における疾患進行の評価との間に重要なつながりをもたらす可能性がある。 神経細胞の細胞質タンパク質であるニューロフィラメント軽鎖(NF-L)は、軸索の損傷に起因する様々な神経細胞疾患で増加する。 ALS(筋萎縮性側索硬化症)患者では、NF-Lレベルの強い上昇が認められた(Gaetani et. al, 2018)。 そこで、低コピートランスジェニックマウスモデルSOD1-G93AでNF-Lレベルを調べた。 血漿中のNF-Lレベルの増加は、24週齢ですでに観察され、27週齢で有意になった(図1)。 家族性アルツハイマー病モデルマウス5xFADでは、血漿中NF-Lレベルの上昇が6ヶ月齢ですでに観察された(図2A)。 さらに、9ヵ月齢の5xFADマウスでは、CSF NF-Lレベルの強い上昇が検出される(図2B)。 図1:低コピーSOD1-G93Aマウスの血漿中のニューロフィラメント軽鎖の定量。 24週齢、27週齢、30週齢のSOD1-G93Aマウスの血漿中NF-Lレベル(pg/mL)と非トランスジェニック同腹子(ntg)の比較。 Two-way ANOVAとTukeyのポストホック検定。 平均値+SEM。 *p<0.05; ***p<0.001。 *ntgとの比較;#年齢群間の差。 図2:5xFADマウスの血漿および髄液中のニューロフィラメント軽鎖の定量。 A: 3、6、9、12ヶ月齢の5xFADマウスの血漿中NF-Lレベル(pg/mL)を非トランスジェニック同腹子(ntg)と比較。 二元配置分散分析とBonferroniのポストホック検定。B:9ヶ月齢の5xFADマウスの髄液中のNF-Lレベル(pg/mL)をntgと比較。 対応のないt検定。 AおよびB:平均+SEM。 *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。ニューロフィラメント軽鎖レベルの研究組織分析については、今すぐお問い合わせください!
プラーク関連炎症に関心がありますか? SCANTOXは、プラークに関連する炎症の可視化と定量化のパートナーです。 図1は、アミロイドβプラーク(6E10標識)に隣接するミクログリア(Iba1標識)を評価するための例示的な定量化プロセスである。 多チャンネル免疫蛍光法(1回の実験で最大4種類の抗体とDAPI標識)、全スライドイメージング、定量画像解析により、病理学的変化を詳細に評価することができる。 画像解析は、Image-Pro 10ソフトウェアを使用したマクロベースであるため、大量の画像バッチを迅速かつコスト効率よく定量化できる。 重要なことは、結果がオペレーターに依存せず、完全に再現可能であることである。 図1:10ヶ月齢の5xFADマウス脳切片の免疫標識と、プラークに関連したミクログリアの活性化を定量化するための解析過程。 A: アミロイドベータ(赤:6E10)とミクログリア(白:Iba1)のシグナルを合成;細胞核はDAPI(青)で標識。B-D:6E10のシングルチャンネルイメージ。 スケールバー:50 µm。(B)、Iba1(C)、DAPI(D)。E-I:定量化プロセス:まず、適切な閾値処理と形態学的フィルタリングにより、6E10免疫反応陽性物体(プラーク)を同定する(E)。 次に、評価された6E10陽性領域のマスク画像を作成し(F)、6E10陽性領域の境界を全方向に15μm拡張する(G、H)。 最後に、アミロイドβプラーク近傍のIba1陽性物体(活性化ミクログリア)を定量化した(I)。プラークに関連した炎症についてアルツハイマー病研究組織の解析をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
野生型マウスに三硝酸グリセリル(別名ニトログリセリン、NTG)を注射することは、片頭痛様症状を誘発するための迅速かつ強固な方法であり、利用可能な片頭痛治療薬で効率的に治療することができる。 片頭痛とそれに伴う頭痛や神経症状は、世界中で10億人以上の人々に影響を及ぼしている深刻な障害症状である。 片頭痛は最も一般的な神経疾患の一つであるが、それについてはまだあまり知られておらず、この病態を研究するための迅速なモデルの必要性が強調されている。 ニトログリセリン(NTG)の単回投与(1日目)と隔日投与(9日間)の繰り返しにより、野生型マウスの侵害受容が増加する(図1B)。 侵害受容は、スマトリプタンを投与することでベースラインレベルに戻すことができる。 最後のNTG注射から1週間後(16日目)には、全群が侵害受容のベースラインレベルに戻っており、NTG治療の急性効果を示している(Fig.1B)。 図1:野生型マウスにおける片頭痛様症状を示す侵害受容反応に対するニトログリセリン(NTG)の急性注射(1日目)および反復注射(1~9日目)の効果。 (A)3ヵ月齢の野生型マウスに、ニトログリセリン単独(NTG;10mg/kg、i.p.)またはスマトリプタン(スマ;0.6mg/kg、i.p.)と併用して注射し、注射レジメに従ってコントロールした。 (B)片頭痛様侵害受容反応に関連する顔の表情のスコア。 高得点は片頭痛様症状を示す。 下線を引いた1日目、9日目、16日目、注射2時間後にGrimace scaleをスコア化した。 1日目および9日目:n=24/群、16日目:n=12/群;二元配置分散分析(Bonferronipost hoctest);平均値±SEM。 **p<0.01、***p<0.001。 片頭痛は3対1の割合で女性患者が男性患者より多く罹患する。 しかし、このマウスモデルでは、男女ともにニトログリセリン誘発性頭痛症状を示し(図2)、男女を問わず片頭痛研究のモデルとして有効である。 図2:男性(A)と女性(B)におけるニトログリセリン(NTG)注射の効果 (A)と雌 (B)マウスの侵害受容反応に及ぼす影響。 図1のデータを性別で分離。 1日目および9日目:n = 12 /群、16日目:n = 6 /群;二元配置分散分析(Bonferroniポストホックテスト付き);平均値±SEM。 **p<0.01、***p<0.001。 このニトログリセリン誘発片頭痛モデルの特徴づけはまだ進行中であるが、最初の結果は、このモデルがin vivoで片頭痛病態を研究するための迅速で強固な選択肢であることを有望視するものである。片頭痛研究を開始するには、今すぐ弊社にご連絡ください!
AAV2 hA53T-α-synウイルス粒子を野生型マウスに片側注射することは、パーキンソン病の脳病態をモデル化するための迅速かつ確実な方法である。 AAV2 hA53T-α-synを黒質に一回片側注射すると、9週間後にはすでに同側半球の黒質だけでなく尾状核にもhA53T-α-synが選択的に発現する(図1)。図1:hA53T-α 黒質における-syn免疫反応領域(IR) (A)と尾状被殻 (B)における免疫反応領域(IR)。 同側半球の黒質に α-synを注射。 注射から9週間後に動物を安楽死させ、ヒト特異的α-syn抗体を用いて脳を評価した。 n = 5 /群; 対にしないt検定; 平均±SEM。 ***p<0.001。 さらに、神経炎症のマーカーとしてIba1で標識された活性化ミクログリアが、AAV2 hA53T-α-synを注射した半球の黒質で増加している。 チロシン水酸化酵素はAAV2 hA53T-α-synを注射した黒質で有意に減少しており、これは注射した半球でドーパミン作動系が障害されていることを示している(図2)。 図2:Iba1 (A)とTH (B)同側半球黒質へのAAV2 hA53T-α-syn注入後の対側および同側半球黒質における免疫反応領域(IR)。 注射9週後に安楽死させた。 n = 5 /群; 対にしないt検定; 平均±SEM。 *p<0.05; **p<0.01。 C:同側半球の黒質へのAAV2 hA53T-α-syn注射後の、対側および同側半球の黒質におけるhA53T-α-syn、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、Iba1およびDAPI標識の代表的な画像。 病態の発現が速いため、この新しいAAV2 hA53T-α-synはパーキンソン病in vivo試験の迅速な処理を可能にします。AAV2 hA53T-α-synマウスモデルでの試験を開始するには、今すぐお問い合わせください!
タウオパチー患者から精製したタウ凝集体をマウスの脳に注入すると、患者のタウオパチーの主な病理学的特徴を再現することができる。 このアプローチにより、タウオパチーに特異的な病態を解析することが可能となり、高いトランスレーショナルバリューを持つ。 注入には、ヒトタウを発現するが内因性タウを欠く9-10週齢のhTauマウスを用いた。 マウスは、AD BraakステージVI患者のサルコシル不溶性タウの種子を海馬とその上の頭頂皮質に片側注射された。 注射から12週間後に動物を犠牲にし、セリン202/スレオニン205(pSer202/pThr205)のリン酸化タウの病理学的変化について脳を分析した。 リン酸化タウは同側の大脳皮質と海馬だけでなく、対側半球でも測定可能であり、タウの播種と対側へのタウの拡散を示した(図1)。 図1:同側半球の海馬とその上の皮質に片側AD脳シードを注入した後、反対側半球と同側半球の頭頂皮質(A)と海馬(B、C)におけるpSer202/pThr205タウ免疫反応性。 注入12週後に安楽死させ、AT8抗体を用いて脳を評価した。 IR = 免疫反応領域。 n = 8 /群; 2-way ANOVAとŠídák´spost hoc検定による多重比較; 平均+SEM。 *p<0.05; ***p<0.001。 ニューロン、アストロサイトーシス、細胞核を標識するマーカーを用いた脳組織切片の免疫組織学的解析により、注射した同側半球の歯状回顆粒細胞層の構造変化が明らかになった(図2)。 図2:神経細胞体節のマーカーであるNeuN、アストロサイトーシスのマーカーであるグリア線維酸性タンパク質(GFAP)の免疫蛍光標識と、細胞核を可視化するためのDAPI染色。 タウシードを注入した同側と対照側の歯状回顆粒細胞層の構造変化に注目(白矢印頭)。 この結果は、AD患者由来のタウ凝集体の播種が、構造的・生理学的レベルでタウオパチーを忠実に模倣していることを示唆しており、したがってこのモデルがタウオパチーを研究するための貴重なツールとなっている。タウ播種研究の開始については、今すぐお問い合わせください!
超音波発声(USV)の測定は、げっ歯類の社会行動を研究するためのユニークで穏やかな方法を提供する。 マウスは、仔マウスが雌マウスから引き離されたときや、成熟した雄マウスが雌マウスに接触したときなど、生涯を通じてさまざまな社会的状況で超音波発声を行う。 後者の場合、オスのマウスは通常30~110kHzの超音波を発する。 これらの発声は、情動、社会的関心、意欲の指標と考えられている。 社会的コミュニケーション障害を測定するために、我々はFmr1-KOマウスを用いた。Fmr1-KOマウスは自閉症スペクトラム障害のモデルであり、異常な社会的表現型など幅広い行動異常を示すことが知られている。 10週齢のFmr1-KO雄および対照C57BL/6を用いて、性的に受容的な雌の尿に曝露したときのUSVエミッションの記録を確立した。 発声は、赤色光条件下でAvisoft技術を用いて5分間記録した。 発声の総数と、最初の発声が始まるまでの潜伏時間を、5分間の記録全体について測定した。 USV録音の結果、Fmr1-KOマウスは対照のC57BL/6マウスに比べて発声数が有意に減少した(図1)。 しかし、最初の呼びかけを開始するまでの潜伏時間は変わらなかった(データは示さず)。 図1. 超音波発声の回数。 5分間の録音セッション中の発声回数。 n=15/群;平均+SEM(Students’ t-test、Mann-Whitneyのpost hoctestによる); **p<0.01。 超音波発声の測定は、他のマウスモデル、異なる社会的文脈におけるマウス、あるいはラットの評価に容易に調整することができる。超音波発声の変化に関する動物実験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
複合筋活動電位(CMAP)は、麻酔をかけた動物の筋肉の機能状態をモニターするために一般的に用いられている電気生理学的手法である。 CMAP測定は、末梢神経筋系の生理学的発達や変性に関する洞察を提供する。 筋電図(EMG)評価の一環として、CMAPはヒトの診断および臨床研究において定期的に使用されており、明確なトランスレーショナルバリューを提供している。 記録手順は、運動神経を上限の刺激で刺激し、筋からの反応を記録することからなる。 様々なCMAP特性の変化は、運動軸索の喪失、神経に沿った信号伝達速度の低下、筋力低下を反映するため、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、さらにはアルツハイマー病や ポンペ病のようなライソゾーム貯蔵疾患のような神経変性疾患に直接関連する。 SOD1-G93AALSモデルマウスのCMAP評価では、最大CMAP反応が著しく低下し(図1 A)、発症までの潜時(図1 B)、通常のCMAP持続時間(図1 C)、運動軸索の変性、神経から筋への信号伝達速度の低下、筋線維間の生理的同期が示唆された。 また、SOD1-G93Aマウスの筋は、反復刺激後にCMAP振幅の減少を示し(図2)、神経筋接合部の病的変化による筋力低下を示唆した。 図1:SOD1-G93Aマウスの腓腹筋における複合筋活動電位(CMAP)。 CMAP最大振幅 (A)、CMAP発現までの潜時 (B)、CMAP持続時間 (C)、CMAP持続時間と振幅の比 (D). 対応のないt検定。 n=8/群。 平均値+SEM。 **p<0.01。図2:SOD1-G93Aマウスにおける腓腹筋の筋力低下。1回目の反応と5回目の反応を比較したときの誘発反応の変化。 (A)および10回目の反応 (B). 対応のないt検定。 n=6/群。 平均値+SEM。 *p<0.05。SOD1-G93Aマウスの試験を開始するには、今すぐお問い合わせください!
FMR1遺伝子(Fragile X mental retardation 1)の変異は、Fragile X症候群(FXS)と呼ばれるX連鎖性遺伝性障害につながり、知的障害の中で最も頻繁に遺伝する形態であり、自閉症スペクトラム障害(ASD)の単発性原因である。 ASD患者は、コミュニケーションや社会性の障害、興味を制限された反復行動、多動性を示す。 エクソン5の200以上のCGGリピートをネオマイシン耐性カセットで置換することによってFMR1遺伝子をサイレンシングすることは、FXSとASDを研究するための貴重なツールとなる。Fmr1-KOマウスは、野生型マウスと比較して、社会的コミュニケーションの欠陥、高レベルの多動性、高レベルの反復行動を示す(2021年10月ニュースレター参照)。 Fmr1-KOマウスのこうした行動特性は、FXSやASDを調査し、新しく開発された化合物の有効性を試験するための貴重なツールとなっている。 Fmr1-KOマウスの脳組織を用いた新たな組織学的評価では、7週齢の雄マウスの尾状被蓋において、C57BL/6J動物に比べて活性化ミクログリアのレベルが増加していることが示された(図1 AおよびC)。 さらに、ミエリンを定量したところ、7週齢の雄性Fmr1-KOマウスの脳梁では、年齢をマッチさせたC57BL/6Jマウスと比較してレベルが増加していた(図1 BおよびD)。 神経炎症マーカーIba1とミエリン塩基性タンパク質(MBP)の代表的な画像を図2に示す。 これらのデータは、活性化ミクログリアのIba1と髄鞘形成レベルで評価される神経炎症が、薬効試験中の疾患の重症度やこれらのパラメーターの変化を解析するための貴重なマーカーになり得ることを示唆している。図1:7週齢のFmr1-KOマウスとB6マウスにおけるIba1とミエリン塩基性タンパク質の定量。尾状被蓋におけるIba1 IR面積と物体密度(Aおよび C). 脳梁のMBP IR面積と物体密度(Bと D). 非対t検定。 n=5/群。 平均値±SEM。 *p<0.05, ***p<0.001。図2:7週齢のC57BL/6JマウスとFmr1-KOマウスにおけるIba1(緑)、MBP(赤)、NeuN(青、CCのみ)の代表画像。尾状核(CPu)、脳梁(CC)。Fmr1-KOマウスの研究をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
培養細胞の自発的な神経細胞活動は、神経細胞の健康状態に関連する生理学的に最も関連性の高い読み出し値の一つである。 カルシウム濃度は、神経活動の有能な間接的レポーターとして神経科学で広く用いられている。活動電位(AP)発火は、電位依存性カルシウムチャネルを介したCa2+の大量流入を引き起こすからである。 IncuCyte®NeuroBurst(遺伝子コード化カルシウムインジケータ(GECI))をIncuCyte®ライブセルイメージングシステムと組み合わせることで、培養細胞内の数千の機能性ニューロンの形態学的変化をモニターし、ニューロン活動を長期間にわたって測定することができる。 神経細胞の自発活動を解析するために、ラットの初代神経細胞をNeuroBurstで形質導入し、DIV8まで培養する。 その後、処理を行う前に、IncuCyte® ライブセルイメージングシステムで細胞の自発的ベースライン活動を解析する。 細胞は 処理後6、12、24、48、72時間後に、IncuCyte®ライブセルイメージングシステムを用いて細胞の反応を再度モニターする。 3つの項目はすべて、それぞれのビヒクルコントロール(VC)と比較して期待される結果を示した。 MK-801処理は、その抗興奮活性を反映して活性ニューロンの減少をもたらすが、ピクロトキシンとフォルスコリンは活性ニューロン数を増加させる(図1A)。 フォルスコリンはさらに、投与開始から72時間後までのバースト率に影響を与え(図1B)、ピクロトキシンは神経細胞活動の相関性と同期性に強く速い影響を示した(図1C)。 図1:IncuCyte® NeuroBurstを用いた、治療に対する神経細胞活動の経時的モニタリング。 A:ウェルあたりの活性神経細胞数(記録時間あたり少なくとも1回バーストした対象)、B:1分あたりのバースト総数として示したバースト率、C:神経細胞活動の相関性を、すべての対象物の平均値として示したもの(0は完全にランダム、1は高度に同期している)。 データは、統合されたIncuCyte® Neuronal Activity Analysis Software Moduleにより作成された。 ビデオ96ウェルマイクロプレートに30,000cells/wellで播種したラット初代皮質ニューロンをIncuCyte® NeuroBurst Orange試薬に感染させ、ニューロン活動を徐々にモニターした。 DIV10(処理開始から48時間後;ピクロトキシン、フォルスコリン、MK801またはビヒクルコントロール(VC)による処理)に撮影した動画は、異なる処理による自発的な神経細胞活動(カルシウム振動)の変化を示している。 したがって、ラットの一次ニューロンを使用して、自発的なニューロン活動を評価することができる。 参照化合物として、ピクロトキシン、MK-801、フォルスコリンを用いることができる。
ハンチントン病(HD)は常染色体優性遺伝する致死的な神経変性疾患である。 患者は運動機能障害、精神症状、認知障害、代謝異常を呈する。 HDは、ハンティンチン遺伝子HTTのコード領域におけるCAG塩基三重鎖の不安定な反復の拡大のみによって引き起こされる。 発症年齢はCAGリピートの長さと逆相関し、40〜50歳で始まる。 SCANTOXは現在、げっ歯類モデルであるR6/2マウスと BACHDラットに加えて、zQ175DN-KIマウスモデルも提供し、新規化合物のin vivoでの有効性を試験している。 これらのzQ175DN-KIマウスでは、マウスHTTエクソン1が、180-220のCAG反復を有するヒトHTTエクソン1配列に置換されている。 さらに、これらのKIマウスのneoカセットは欠失(DN)している。 zQ175DN-KIマウスの最初の社内評価では、変異HTT(mHTT)が5.5カ月齢の動物の大脳等位部で高発現していることが示された(図1A)。一方、体重は23週齢で有意に減少したが、最初の体重影響は12週齢ですでに見られた(図1B)。 行動障害を評価したところ、zQ175DN-KIマウスは巣作りおよび 梁上歩行試験において有意な障害を示し、それぞれ巣作りスコアの低下および10mm角の梁上でのスリップ回数の増加によって示された(図2AおよびB)。 これらの予備的な結果から、zQ175DN-KIマウスにおける変異型ヒトHTT遺伝子のノックインにより、mHTTレベルが非常に上昇し、その結果、5.5ヶ月齢の時点ですでに体重が減少し、一般的な健康状態および運動能力が著しく低下していることが示唆された。 したがって、zQ175DN-KIマウスは、ハンチントン病に対する新規化合物を試験するための貴重なツールである。 図1:5.5ヶ月齢のzQ175DN KIマウスと野生型マウスの雌雄混合のmHTTと体重の定量。 A: MesoScale Discoveryプラットフォームを用いたサンドイッチ免疫吸着アッセイによる等軸皮質内のmHTT定量化。 WT: n = 3; zQ175DN KI: n = 12。 平均値+SEM。 非対t検定。 B:体重増加。 各群n = 12。 平均値±SEM;シダックの多重比較ポストホック検定による反復測定二元配置分散分析;体重の進行の分析は、両遺伝子型についてTukeyの多重比較ポストホック検定により有意であった(ラベルなし)。 *p<0.05; ***p<0.001。 mHTT:変異ハンチンチン;WT:野生型。 図2. zQ175DN KIマウスとWTマウスの雌雄混合5.5ヶ月齢の巣作りと梁歩行。 A:巣作りのスコアは1が貧弱な巣、5が完璧な巣。 B:10mm角の梁上でのスリップ数。 各群n = 12。 平均値+SEM;Mann-Whitney U検定 (A)または対応のないt-検定 (B). **p<0.01.***p<0.001。zQ175DN KIマウスを用いた試験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
ヒトGBA(グルコシルセラミダーゼ-β)遺伝子の変異は、グルコシルセラミダーゼ-β(GCase)活性の低下と関連しており、ゴーシェ病の発症に関係することが示されている。 さらに、この酵素はパーキンソン病研究の治療標的として大いに議論されている。 GBA-D409V-KIマウスモデルは、成熟ヒトGBAタンパク質のD409V変異に対応する変異型D427V GBAタンパク質を発現している。 これらのマウスの肝臓と脳におけるGCase活性を生化学的に解析したところ、ホモ接合体GBA-D409V-KIマウスではGCase活性レベルが著しく低下しており、ヘテロ接合体GBA-D409V-KIマウスでは中程度であるが非常に有意なGCase活性レベルの低下が認められた(図1AおよびB)。 GBA-D409V-KIマウスの脳内可溶性および不溶性α-シヌクレインレベルを評価したところ、ホモ接合体GBA-D409V-KIマウスの脳内可溶性画分中のα-シヌクレインレベルは野生型同腹子と比較して有意に増加した。 不溶性脳画分中のα-シヌクレインレベルは変化しなかった(データは示さず)。 対応するin vitroモデルで新薬を試験するため、E14 GBA-D409V-KIマウスのマウス胚線維芽細胞でGCase活性を評価したところ、ホモ接合型GBA-D409V-KIマウスでは酵素活性が強く低下していた。 イソファゴミンは、ビヒクルコントロール(VC、図2)と比較して、ヘテロ接合体マウスのGCase活性を有意に増加させることができた。 したがって、GBA-D409V-KIマウスおよびそのMEFは、GCAse活性を標的とする新規化合物を評価するための貴重なツールである。 図1. GBA-D409V-KIマウスの肝臓と脳における加齢に伴うGCase活性。 肝臓におけるGCase活性(μM/h (A)と脳 (ホモ(tm/tm)およびヘテロ接合体(wt/tm)GBA-D409V-KIマウス、および年齢をマッチさせた野生型同腹子(wt/wt)の4、6、8、12ヶ月齢における肝臓(A)および脳(B)におけるGCase活性をμM/hで示した。 二元配置ANOVAとBonferroniのポストホック検定;平均+SEM;***p<0.001。 図2. ビヒクル(VC)またはイソファゴミン(IFG)で処理したGBA-D409V-KIマウス胚線維芽細胞(MEF)におけるGCase活性。 マウス胚線維芽細胞を、ホモ(tm/tm)およびヘテロ接合体(wt/tm)のGBA-D409V-KI E14胚と、年齢をマッチさせた野生型同腹子(wt/wt)から単離した。 細胞を96ウェルプレートで培養し、ビヒクル(0.1 % DMSO)または20 µMイソファゴミンで7日間処理した。 その後、細胞をオンセル4-MUGアッセイまたはクリスタルバイオレットアッセイに供した。 データは、クリスタルバイオレットアッセイから得られた光学密度(OD)値で正規化した4-MUGアッセイの相対蛍光単位(RFU)で示した。 Two-way ANOVA with Bonferroni`spost hoctest; mean + SEM; *p<0.05; **p<0.01。
ポンペ病モデルマウスとして若い6neoマウスの筋力低下と運動障害を検証した後、我々の研究チームは、このライソゾーム貯蔵病モデルマウスの非神経細胞組織と神経細胞組織における酵素の減少とグリコーゲン基質レベルを検証するために、酸性α-グルコシダーゼ(GAA)酵素活性を評価した。 そこで、ポンペ6neoマウスの大腿四頭筋と皮質組織を、それぞれ4-MUGベースのGAAアッセイと市販のグリコーゲンアッセイキット(Sigma, MAK016-1KT)を用いて、GAAとグリコーゲンレベルについて分析した。 24週齢の6neoマウスでは、大腿四頭筋と大脳皮質でGAA活性が高度に低下しており(それぞれ図1AとB)、ポンペ病治療薬開発におけるこのモデルマウスの価値が検証された。図1:6neoマウスの大腿四頭筋および大脳皮質におけるα-グルコシダーゼ(GAA)活性。大腿四頭筋 (A)と皮質組織 (24週齢の6neoマウスの大腿四頭筋(A)と皮質組織(B)のGAA活性を解析した。 n = 16/群;平均値+SEM;不対t-検定;***p<0.001。 6neoマウスの大腿四頭筋では、4週齢ですでにグリコーゲンレベルが非常に上昇している。 年齢とともに、グリコーゲンレベルはさらに上昇する(図2A)。 大脳皮質のグリコーゲンレベルを評価したところ、4週齢では有意な変化は見られなかったが、24週齢でグリコーゲンレベルが非常に上昇し、加齢とともにさらに増幅した(図2B)。 このように、基質の蓄積は非神経細胞組織ではより早く始まる。図2:6neoマウスの大腿四頭筋および大脳皮質におけるグリコーゲンレベル。4週齢と24週齢の6neoマウスの大腿四頭筋(A)と、4週齢、24週齢、52週齢の6neoマウスの皮質組織(B)のグリコーゲン量を分析した。 n = 16/群;平均値+SEM;二元配置分散分析(ANOVA)後、ボンフェローニの多重比較ポストホック検定;***/###p<0.001;*遺伝子型間の有意性;#年齢群間の有意性。 我々は以前、8週齢で初めてin vivoでの筋欠損を観察したように、グリコーゲン基質の蓄積はin vivoでの変化を進行させるようである。 これらの結果は、6neomiceがポンペ病を研究し、この病気の壊滅的な症状を改善するために有効な新規化合物を試験するための貴重なツールであることをさらにアピールするものである。6neo マウスを用いた研究をご希望の方は、今すぐ弊社までご連絡ください!