神経変性疾患における常在脳マクロファージであるミクログリアの重要性はよく知られており、そのためこれらの細胞は新しい薬理学的介入の標的として頻繁に用いられている。 SCANTOXでは、マウスから生後早期のミクログリアを細胞分離することは、この特定の細胞タイプのin vitro分析法として確立され、標準化された方法である。 さらに最近、磁気細胞選別法(MACS)によって成体マウスからミクログリア細胞を分離する方法を確立した。 トランスジェニックマウス、あるいは化合物治療マウスの成体脳から純粋なミクログリア画分を作製することで、治療の有効性を評価するためのさまざまな新しい可能性が開かれる。 遺伝子発現やバイオマーカーの細胞タイプ特異的解析、あるいはこれらの細胞の追加培養や刺激によって、未解決の疑問に答えることができる。 すべての残存細胞を含む画分(フロースルー、FT)と比較したミクログリア画分の純度は、ミクログリアマーカーItgam(CD11b)とアストロサイトマーカーGFAPのmRNA解析によって評価した(図1)。 その結果、ミクログリア画分では、FTと比較してItgam陽性細胞が強く濃縮され(図1A)、ミクログリア画分ではGFAP発現がないか、あるいは極めて少ないことが示された(図1B)。 さらに、細胞型特異的mRNA発現の例として、5xFADマウスから単離したミクログリアにおいて、RT-PCRによるIL-6とMYD88の解析を、非トランスジェニック同腹子と比較して行った(図2)。 興味深いことに、老化した5xFADマウスのミクログリアでは、IL-6発現の高い増加がMYD88発現レベルの減少を伴っている。 図1:以下のRT-PCR増幅グラフ (A)イトガムと (B)9.5ヶ月齢のマウスの脳から調製した3つのミクログリアとフロースルー画分におけるGFAP SYBR greenシグナル。 グラフは、1サイクルあたりのSYBR greenシグナルの相対蛍光単位(RFU)を示す。 図2:9.5ヶ月齢の非トランスジェニック(nTG)マウスおよび5xFADマウス脳のミクログリア画分におけるIL-6およびMYD88 mRNA発現レベル。 データはnTGマウスと比較したx-fold変化で示し、棒グラフ+SDで示した(各群n=4-5)。 統計解析:対のないt検定。 *p<0.05; **p<0.01。in vivoモデルのミクログリアの単離をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は多発性硬化症(MS)と多くの病理学的類似性を示すため、ミエリン-オリゴデンドロサイト-糖タンパク質(MOG)と百日咳毒素(PTX)を組み合わせて注射することによりMSを模倣するモデルとしてよく用いられる。 C57Bl/6マウスはMOG+PTX投与後約2週間で臨床症状を発症する。 フィンゴリモド(Fingo)は、投与2週間後に臨床症状を有意に減少させることができた(図1a)。 オープンフィールド試験における全動物の評価では、MOG + PTX治療により、飼育行動が完全に減少した。 フィンゴリモドはこの表現型を救うことができなかった(図1b)。 ワイヤー懸垂試験における筋力の解析では、MOG + PTX投与マウスのぶら下がり時間が著しく減少した。 この表現型はフィンゴリモドによって部分的に救済された(図1c)。 MOG+PTX投与マウスの運動協調性は、RotaRod試験で解析されたように、強く損なわれていた。 フィンゴリモドはこの表現型も部分的に救済することができた(図1d)。 MOG+PTX投与マウスはEAEの症状を忠実に模倣しており、したがって多発性硬化症の優れたモデルである。 このモデルは、新規MS化合物の一次スクリーニングツールとして広く用いられている。図1:EAEマウスの臨床症状と運動障害。 EAEを誘発したC57Bl/6マウスについて、臨床症状 (A)、オープンフィールド試験における飼育活動性 (B)、ワイヤーサスペンション試験における筋力 (C)およびRotaRodテストにおける協調運動(D)について、ビヒクル投与マウスと比較した。 (D)をビヒクル投与マウスおよびEAE+Fingo投与マウスと比較した。 n = 13-16/群; 平均値+SEM; Kruskal-Wallis 一元配置分散分析後、Dunnの多重比較ポストホック検定; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。 *EAE-車両 vs. Sham-車両; #EAE-フィンゴ vs. EAE-車両。 Fingo = Fingolimod。EAE誘発マウスモデルでの試験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
多発性硬化症(MS)はヒト特有の疾患であり、若年成人に最も多くみられる神経疾患の一つである。 神経症状は多岐にわたり、病気の進行も様々であるが、主な特徴は、脱髄、神経炎症、神経変性であり、その結果、持続的な障害が生じる。 MSのモデル化と新薬の試験には、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルがよく用いられる。 ここでは、10週齢の雌性C57Bl/6マウスにMOGと百日咳毒素を投与してEAEを誘発し、頚髄における神経炎症と脱髄を評価した。 EAEを誘発した1群には、病態を予防するために参考項目としてフィンゴリモドを慢性的に投与した。 CD45(図1、代表画像)およびIba1レベル(図1)の上昇によって示されるように、EAE誘発は頸髄に強い炎症を引き起こすことがわかる。 フィンゴリモドによる治療は、このモデルの神経病理学的特徴を軽減することができ、したがって貴重な陽性対照となる。 同じ動物で髄鞘形成を評価したところ、EAE誘発マウスでは偽薬投与マウスに比べて髄鞘が強く減少していた(図2)。 さらに、血漿中のニューロフィラメント-軽鎖(NF-L)レベルを解析したところ、EAE誘発によってレベルが非常に上昇したが、フィンゴリモド治療によって防ぐことができた(図2)。 図1. 頚髄における神経炎症。 CD45標識による白血球、Iba1標識による活性化ミクログリア、DAPIによる核のカウンターステインを示す免疫蛍光標識の代表画像(偽薬投与マウスとEAE誘発マウス)。 グラフは、偽薬投与マウス、EAE誘発マウス、およびフィンゴリモドを追加投与したEAE誘発マウスの頚髄白質におけるIba1の免疫反応面積(%)を示す。 グラフは、マウス1匹につき1-2脊髄切片の関心領域内で測定した免疫蛍光シグナルの平均値を示す(各群n = 6-8)。 一元配置分散分析の後、Bonferroniのポストホック検定を行った。 平均値+SEM。 *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。 図2. EAEマウスモデルにおける神経変性過程。 偽薬投与マウスとEAE誘発マウスのミエリンを示すLuxol Fast Blue染色の代表画像。 EAE誘発マウスでは染色が弱く、脱髄を示している(左)。 偽薬投与マウス、EAE誘発マウス、フィンゴリモドを追加投与したEAE誘発マウスの血漿中のニューロフィラメント-軽鎖レベルの定量。 (各群n = 6)。 一元配置分散分析(One-way ANOVA)とTukeyのポストホック検定。 平均値+SEM。 **p<0.01; ***p<0.001。EAE誘発マウスモデルでの試験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
RNA結合タンパク質TDP-43は、ALSやFTLDのような神経変性疾患と強く関連している。 いくつかの研究から、細胞質内のTDP-43凝集体がストレス顆粒マーカーと共局在することが示されている。 ストレス顆粒(SG)は、細胞ストレス時にRNAのサブセットの翻訳を抑制する細胞質封入体である。 SGの形成がTDP-43の蓄積に寄与することが示されて以来、SG形成の阻害やTDP-43のSGへの動員は、現在ALS研究の焦点となっている経路である。 この研究を支援するために、TDP-43過剰発現神経芽腫細胞を用いて、それぞれのin vitroモデルを構築した。 そこで、よく知られているSG誘導剤である亜ヒ酸ナトリウム(SA)で細胞を処理し、proteinsimple WES技術(図1)を用いて可溶性および不溶性タンパク質画分におけるTDP-43の凝集を調べるとともに、免疫細胞化学(図2)を用いてSGの形成とTDP-43のリクルートメントを調べた。 WES解析では、SA処理によりTDP-43が可溶性から不溶性へと強くシフトすることが示された(図1)。 SGマーカーであるG3BPに対する免疫細胞化学的染色では、SA処理細胞において、それぞれのビヒクル対照と比較して、かなりのSG形成が認められた(図2)。 先に示したように、シクロヘキシミドはSG形成を抑制することができる(図2下段)。 図1. 可溶性および不溶性TDP-43レベルに対する亜ヒ酸ナトリウム(SA)処理の影響. Cells were harvested after SA or vehicle treatment and a soluble and insoluble protein fraction were separated. Both fractions were analyzed for TDP-43 on proteinsimple WES. WES lane view of TDP-43 signal in soluble and insoluble fraction. 図2. 亜ヒ酸ナトリウムとシルクロヘキサミドで処理したSH-TDP-43細胞の代表的画像. Vehicle (VC 0.1% … Read more
進行性運動ニューロン疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、急速に進行する筋萎縮とそれに伴う運動症状を特徴とする。 脊髄の上部および下部の運動ニューロンの変性が、観察される運動機能低下の主な原因であり、アストロサイトーシスや多くの活性化ミクログリアの発生によって観察される強い神経炎症と並行している。 ALSの前臨床モデルであるSOD1-G93A/lowトランスジェニックマウスは、一般的に使用されるSOD1-G93Aモデルと比較して遺伝子コピー数が少なく、G93A変異を有するSOD1を発現しているため、症状の発現が遅延し、生存期間が延長する。 ここで我々は、雄性SOD1-G93A/lowマウスが、生後27週で脊髄の頚部、胸部および腰部腹角でアストロサイトーシスを発症することを示した(GFAP;図1A-C)。 活性化ミクログリアの増加によって決定されるミクログリアシスレベルの変化は、同じ脊髄領域におけるアストログリアシスの変化よりもさらに顕著である。 さらに、活性化ミクログリアは、非トランスジェニック(ntg)同胞(Iba1;図1D-F)と比較して、強い進行を示した。 図1. 雄性SOD1-G93A/lowマウスの脊髄における神経炎症。 24週齢、27週齢、30週齢の雄性SOD1-G93A/lowマウスにおいて、頸部、胸部、腰部腹角の免疫反応性(IR)領域がGFAPで覆われている割合で解析したアストロサイトーシス(A-C)と、同じ脊髄領域におけるIba1 IR領域で解析した活性化ミクログリア(D-F)。G:30週齢の雄性SOD1-G93A/lowマウスの頚髄におけるIba1標識の代表的な画像をntg同腹子と比較した。 二元配置分散分析(Tukey’sおよびSidakの多重比較ポストホック検定付き)。 平均値+SEM。 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。 *遺伝子型間の差;#年齢群間の差。 DH:背側角;VH:腹側角。SOD1-G93A/lowマウスを用いた試験をご希望の方は、お気軽にお問い合わせください!
軸索機能の病理学的変化は、多くの神経疾患の特徴としてよく知られている。今日、傷害後の軸索修復を刺激することは、新しい治療薬の開発にとって重要な側面である。マイクロ流体チャンバー(MFC)を用いることで、ソーマから独立した軸索コンパートメントに関するユニークな知見を得ることができる。そこで我々は、野生型成体マウスの解離DRGニューロンを用いて、MFCにおける軸索損傷と再成長のモデルを確立した。MFCの体細胞側にニューロンを播種して3日後には、すでに軸索が微小溝を横切り始めている。培養5日後には、軸索は完全に溝を越え、軸索側に美しいネットワークを構築した(図1 A)。その後、軸索コンパートメントから培地を素早く除去することで、神経細胞を軸索切断することができる(図1 B)。発生化合物は、体細胞と軸索室の間の静水圧差を利用することで、軸索側または体細胞のどちらか一方だけに選択的に適用することができる。ビヒクル処理細胞と比較した軸索側へのNGF適用の効果を定量的に解析したところ、交差軸索の数には影響が見られなかったが、分岐と軸索の長さが有意に増加した(図2)。 図1. マイクロ流体チャンバー内の野生型成体マウスのDRGニューロンの代表画像。 DRGニューロンをDIV5まで培養し、固定した。 (A)と (B)機械的軸索切断。 Tubulin III (TubIII)標識で神経細胞とその伸長を可視化し、DAPIで核をカウンターステインした。 軸索切断前の軸索側の交差軸索 (A)と軸索切断による軸索の除去 (B). スケールバー1,000μm。 図2. 軸索切断24時間後の軸索再成長に対するNGF処理の効果。 交差軸索の総数を画像で定量化し、以下のマーカーを評価した。 (A)、交差軸索1本あたりの分岐点数 (B)および全軸索の全長 (C);n=4ウェル/群。 対応のないt検定; *p<0.05;**p<0.01。 VC:ビヒクルコントロール;NGF:神経成長因子。DRGニューロンの研究を開始するには、今すぐお問い合わせください!
弊社はアルツハイマー病協会国際会議(AAIC2020)に出展いたします。2020年7月27日~31日 バーチャルブースにて、弊社チームにお目にかかり、貴社の前臨床および臨床医薬品開発プロセスを成功に導くために弊社がどのようなお手伝いができるか、詳細をご覧ください。 月~木曜日の午前8:00~8:30および午前9:30~10:00(日本時間午前15:00~15:30および16:30~17:00)に、ライブ展示チャットをご利用いただけます。 CEST 15:00-15:30および16:30-17:00)。 AAIC 2020のバーチャルホールにご参加の際は、ぜひポスターもご覧ください:ポスター番号 42825 「神経変性疾患および希少疾患のマウスモデルにおける神経フィラメント-軽鎖」 Irene Schilcher, Tina Loeffler, Stefanie Flunkert, Birgit Hutter-Paierポスター #42691 「LPS刺激器官型脳スライスにおけるインフラマソーム活性化とsTREM2放出の減少」 Irene Schilcher, Tina Loeffler, Stefanie Flunkert, Birgit Hutter-Paierポスター発表 #42853 「ヒトおよびマウスの脳におけるAβ-pE(3)とptauの相関」 Magdalena Temmel, Joerg Neddens, Stefanie Flunkert, Lauren Walker, Johannes Attems, Birgit Hutter-Paier
神経炎症は、中枢神経系に影響を及ぼす神経変性疾患やその他の疾患との闘いにおいて、成長しつつある研究分野である。 TSPOはミトコンドリア外膜タンパク質であり、そのアップレギュレーションがグリア細胞の活性化と関連していることから、最近、ハンチントン病の研究に関心を集めている。 8週齢と15週齢のR6/2マウスの大脳皮質でGFAP、Iba1、TSPOを標識することにより、15週齢のR6/2マウスではアストロサイトの免疫標識が増加する一方、ミクログリアは変化しないことが示された(A、 B). TSPOの解析から、R6/2マウスでは8週齢ですでに免疫反応領域が増加し、15週齢ではさらに増加することが示された(C)。 (C). 図1. R6/2マウスにおける神経炎症。 GFAP(A、アストロサイト)、Iba1(B、ミクログリア)、TSPO(C)で覆われた皮質免疫反応領域の割合。 (C). 高齢のR6/2マウスではGFAPとTSPOが増加している。 DおよびE:グリア細胞(赤)におけるTSPO(緑)の発現を示す免疫蛍光画像。 (D)と前庭のミクログリア (E).R6/2マウスを用いた研究をお考えの方は、今すぐお問い合わせください!
APP研究のためのAPPSLマウスや5xFADマウス、タウ研究のためのhTauマウス、TMHTマウス、PS19マウスは、典型的なアルツハイマー病の病態を幅広く提供しています。 さらに、APPやタウの病態解析のために、無細胞モデルや様々な細胞モデルを含む一連のin vitroシステムが利用可能である。 これらのモデルの疾患症状は様々であるため、研究ニーズに最も適したモデルを選択することができます。前臨床試験を開始するには、今すぐご連絡ください!
Scantoxでは、前臨床試験パッケージの他に、お客様の研究ニーズを満たすための単独サービスも提供しています。 組織学的標識、生化学的分析、細胞培養のために、当社のトランスジェニック動物モデルの組織や細胞をご利用ください。 SCANTOXの細胞培養チームは現在、いくつかの神経細胞やグリア細胞の初代細胞や器官型脳スライスでの実験を提供しています。 組織学チームは現在、4重免疫蛍光標識と自動化された評価者に依存しない画像解析を提供しており、細胞培養実験の解析も行っています。
Scantoxは、トランスジェニックげっ歯類モデル以外に、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)をラットの内側前脳束(MFB)に片側注射し、ドパミン作動性黒質経路の完全な脱神経をもたらすPDのモデル動物として、最も頻繁に用いられている。図1:Wistar Han系雄性ラットのMFBへの生理食塩水(A、B)または6-OHDA(C、D)の片側注射。 冠状脳切片の免疫蛍光標識により、6-OHDA注射後、同側の尾状核(CPu;C)および黒質(SN;D)において、チロシン水酸化酵素(TH;橙色)がほぼ完全に消失していることが明らかになった。 生理食塩水はTHの免疫反応性に影響を与えなかった(A, B)。 細胞核はDAPI(青)で標識した。 AとCの矢印はCPuを、BとDの矢印はSNを示す。 図2:6-OHDA病変ラットのシリンダーテスト。 MFBへの片側6-OHDA注射後の同側前肢使用。 6-OHDAは、生理食塩水を注射した対照動物と比較して、術後3、4、5週目に同側の前肢を使用する頻度を有意に増加させた。 列中の数字は群数(n);平均値+SEM;混合効果分析(Bonferroni´spost hoc検定付き);***p<0.001。図3:アンフェタミンによる6-OHDA注射ラットMFBの同側回旋。6-OHDA注射3週間後のD-アンフェタミンに対する回転反応。 2.5mg/kgのD-アンフェタミンを試験日にi.p.注射した。 30分後、回転計ボウルで回転を分析した。 6-OHDAを注射したラットはほとんど同側回転しか行わなかったが、生理食塩水を注射したラットは同側回転と対側回転をほぼ同数行った (A). 6-OHDAを注射したラットは、生理食塩水を注射した対照ラットに比べて、60分間における同側の回旋の総数が有意に増加していた (B);列中の数字は群数(n);平均+SEM、Mann Whitney検定:***p<0.001。6-OHDA誘発ラットモデルでの試験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください!
LPSで刺激された器官型海馬スライスは、in vitroで、発達段階の化合物が炎症酵素活性化に及ぼす影響を調べるのに最適のツールである。 生後脳の三次元構造と異なる細胞タイプの相互作用を維持することで、このシステムはin vivoの状況に酷似しており、同時に早期スクリーニングにいくつかの利点を提供する: いつでも上清を採取できる BBB透過性の問題に直面することなく、新規化合物を試験する。 準高スループット デキサメタゾンが参照化合物となりうる 以下に示すように、スライス組織内のNLRP3発現と上清中のIL-1β放出などを評価することにより、インフラマソームの活性化をモニターすることができる: 図1:LPS刺激24時間後のマウス海馬スライスにおけるNLRP3の定量。 A: 自動ウェスタンブロットシステム(WES)によるLPS刺激器官型脳スライスのNLRP3定量。B:WESで測定したLPS刺激器官型脳スライスのNLRP3曲線下面積(AUC)値。 整列ドットブロット;平均±SEM;各群n = 3 – 4。 デキサメタゾン(Dexa)を参照化合物とした。 一元配置分散分析(One-way ANOVA)後、Dunnettの多重比較ポストホックテストを行い、LPS処理群と比較した; ***p<0.001.図2:LPS刺激24時間後のマウス海馬スライスによるIL-1ß放出。 整列ドットブロット;平均値±SEM;各群n = 4 – 5。 デキサメタゾン(Dexa)を参照化合物とした。 一元配置分散分析(One-way ANOVA)後、LPS処理群と比較したDunnettの多重比較ポストホック試験; ***p<0.001。インフラムマソーム研究の開始については、今すぐお問い合わせください!