α-시누클레인(α-syn)은 파킨슨병(PD)의 발병에 중요한 역할을 하는 단백질로, A53T 돌연변이를 포함한 이 단백질의 돌연변이는 초기 발병 PD와 관련이 있습니다.
건강한 뉴런에서 α-syn은 시냅스 기능 및 신경전달물질 방출 조절에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 PD에서 α-syn은 잘못 접히고 응집되어 루이체로 알려진 불용성 단백질 침착물을 형성합니다. 이러한 응집체는 PD의 병리학적인 특징이며 응집 또는 올리고머 형태의 α-syn은 흑질에서 도파민 신경세포의 점진적인 퇴행에 기여하는 것으로 알려져 있습니다.
또한, 파킨슨병 환자 및 파킨슨병 동물 모델의 뇌에서 자가포식 경로의 조절 장애가 관찰되어 이 질환에서 자가포식의 중요한 역할을 시사합니다.
α-syn 응집, 시딩 및 자가포식의 다양한 측면을 평가하기 위해 Scantox에서는 불멸화 세포주, 일차 설치류 또는 인간 iPSC 유래 뉴런을 포함한 다양한 세포 시스템 내에서 사용하도록 수정할 수 있는 다음 분석법을 설정할 수 있습니다.
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세포 사멸 또는 시딩을 유도하기 위한 사전 형성된 피브릴(PFF) 또는 올리고머의 적용
재조합 인간 α-syn 원섬유는 시험관 내에서 원피질 마우스 뉴런의 시딩 특성을 평가하고 독성을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.
단량체 인간 α-syn은 세포 생존에 영향을 미치지 않지만, 미리 형성된 야생형 및 A53T 인간 α-syn 피브릴은 일차 피질 마우스 뉴런에 독성 영향을 미칩니다. 이 독성 효과는 올리고머 이성질체에 의해 초과됩니다(그림 1A). 테스트된 동형 중 A53T α-syn 피브릴만이 피질 마우스 뉴런에서 시딩 특성을 보이며(그림 1B), 이는 면역세포화학(그림 2) 또는 단백질 분석을 위한 Mesoscale Discovery 및 WES 플랫폼을 활용한 생화학 분석(그림 3)을 통해 평가할 수 있습니다.
이 쥐 세포 시스템에서 인간 α-syn 대신 쥐를 평가하면 적용된 씨앗의 신호를 포착하는 것을 피할 수 있습니다.
그림 1: 원피질 마우스 뉴런에 대한 α-syn 사전 형성 원 섬유의 시험관 내 평가. 독성 (A) 및 시딩 특성 (B) 일차 피질 마우스 뉴런에 미리 형성된 다양한 재조합 인간 α-syn 종(StressMarq)을 처리한 결과. A: α-syn 종으로 처리된 뉴런과 MTT 분석으로 세포 생존력을 평가한 뉴런. B: α-syn 종으로 처리하고 쥐 α-syn에 대해 면역세포화학적으로 분석한 뉴런. 데이터는 평균 표준 오차(SEM)가 포함된 막대 그래프로 표시됩니다. 통계 분석에는 차량 대조군(VC)에 대한 Dunnett의 사후 검증을 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA)이 사용되었습니다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
그림 2: 미리 형성된 다양한 재조합 인간 α-syn 종으로 시딩한 후 내인성 쥐 α-syn 축적의 대표 이미지(StressMarq). 뉴런을 단량체 (A) 및 A53T 미리 형성된 피브릴로 처리한 신경세포 (B) 및 배양 후 쥐 α-syn에 대해 면역세포화학적으로 염색했습니다. 핵 염색 DAPI = 파란색; 쥐 α-syn = 빨간색; 눈금 막대 100µM.
그림 3: PFF로 자극한 마우스 원피질 뉴런의 용해성 및 불용성 α-syn과 pS129 α-syn. 용해성 쥐 α-syn (A) 및 불용성 쥐 α-syn (B) 메소스케일 디스커버리 플랫폼으로 분석하여 pS129에서 인산화된 불용성 α-syn과 pg/µg 단백질로 표시됨. (C) WES로 분석하고 차량 제어(VC)의 백분율로 정규화된 신호로 표시. 데이터는 그룹 평균 + SEM(그룹당 n=6)의 막대 그래프로 표시됩니다. UT: 미처리, VC: 차량 대조군, 모노머 α-syn 처리 세포, LC: 병변 대조군, PFF α-syn 처리 세포. 통계 분석에는 병변 대조군(LC)과 비교한 Dunnett의 사후 검정( 사후 검정)에 이은 일원 분산 분석(One-way ANOVA)이 사용되었습니다. *p<0.05, ***p<0.001.
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α-시누클레인 응집 및 자가포식 평가
실험용 화합물이 일반적인 α-syn 응집과 자가포식의 변화에 미치는 영향은 야생형 α-syn(SH-SY5Y-SNCA)을 과발현하는 안정적으로 감염된 SH-SY5Y 세포에서 평가할 수 있습니다.
분화된 SH-SY5Y-SNCA 세포를 발달 화합물 또는 기준 항목과 함께 배양한 후, 수용성 및 불용성 단백질 추출을 위해 수확합니다.
α-syn 응집 정도(그림 4) 또는 오토파지 마커의 발현(그림 5)는 MESO QuickPlex SQ 120MM 플랫폼을 사용하거나 면역세포화학을 통해 정량화할 수 있습니다.
그림 4: SH-SY5Y 세포의 인간 용해성 및 불용성 α-syn과 안정적으로 감염된 SH-SY5Y-SNCA. 용해성 α-syn (A) 및 불용성 α-syn (B)를 메소스케일 디스커버리 플랫폼으로 분석하여 ng/mL로 표시했습니다. 데이터는 그룹 평균 + SEM(그룹당 n=6)의 막대 그래프로 표시됩니다.
그림 5: 다양한 처리 후 SH-SY5Y-SNCA 세포에서 오토파지 마커 p62/SQSTM1의 정량화. 라파마이신의 효과 (A) 또는 클로로퀸 (B) 메소스케일 디스커버리 플랫폼으로 분석한 SH-SY5Y-SNCA 세포의 p62 수준에 대한 효과. 데이터는 막대 그래프로 표시되며 그룹 평균 + SEM(그룹당 n=3-6)입니다. VC: 차량 제어. 통계 분석에는 단방향 분산분석(One-way ANOVA)과 VC에 대한 Dunnett의 사후 검정(post hoc test)이 사용되었습니다. **p<0.01, ***p<0.001.
이러한 시험관 내 PD 모델에서 귀사의 화합물의 효능을 평가해 드리겠습니다!