발달 과정에서 뉴런은 다른 뉴런과 시냅스로 연결되는 뉴라이트 돌기라고 하는 축삭과 수상 돌기가 자라나면서 기능적 네트워크로 조립됩니다. 놀랍게도 뉴런은 성인의 뇌에서도 성장과 시냅스 형성을 위한 능력을 유지합니다. 뉴라이트 돌출의 자극과 촉진은 손상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 신경 기능을 회복하는 데 중요합니다. 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경 퇴행성 질환을 표적으로 하는 약물에 대한 유망한 전략은 뉴라이트 돌출의 재생을 촉진하는 것입니다. 따라서 새로운 치료법은 뉴라이트 돌출에 영향을 미치는 분자를 식별하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이를 위해 Scantox는 개발 화합물의 신경 성장 효과를 평가할 수 있는 세포 배양 모델을 제공합니다.
뉴라이트 아웃그로스 솔루션 1
일차 마우스/쥐 해마 또는 피질 뉴런을 DIV1에서 48시간 동안 화합물로 처리합니다. 치료 후, 신경세포의 성장은 IncuCyte® 라벨 없는 생세포 분석 시스템을 사용하여 시간이 지남에 따라 평가됩니다. 생세포 분석 및 치료는 과학적 질문에 따라 연장될 수 있습니다.
그림: 화합물 X(Cmpd X)와 섬유아세포 성장 인자(FGF)가 시간에 따른 원시 마우스 해마 신경세포의 신경돌기 성장 및 분지에 미치는 영향.
데이터는 시간에 따른 곡선(A,
C) 또는 막대 그래프(B,
D) 48시간 처리 후 그룹 평균 + SEM(n=6/그룹).
차량 대조군(VC)과 비교한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이은 Dunnett의 다중 비교 사후 검정; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
뉴라이트 아웃그로스 솔루션 2
일차 마우스/쥐 해마 또는 피질 뉴런을 DIV1에서 48시간 동안 화합물로 처리합니다. 항β-튜불린 III 항체를 사용하여 세포를 간접 면역 형광 분석하고 이미징 모듈이 있는 Cytation5 멀티모드 리더(Biotek)에서 웰당 4-6개의 이미지를 10배 배율로 이미지화합니다. 자동화된 이미지 기반 분석을 사용하여 다음 파라미터가 결정됩니다:
- 총 뉴라이트 성장
- 가장 긴 뉴라이트 길이
- 지점 수
그림: 섬유아세포 성장인자(FGF)가 원시 마우스 해마 신경세포의 신경돌기 성장(NOG)과 분지에 미치는 영향.
데이터는 48시간 처리 후 막대 그래프(A-C)로 표시되며, 그룹 평균 + SEM(n=6/그룹)으로 표시됩니다.
비쌍검정 t-검정; **p<0.01; ***p<0.001.
D: NOG 분석의 대표 이미지.
β-튜불린 III에 대해 차량(VC) 또는 FGF로 처리된 세포를 염색했습니다.
분석 전(위쪽 줄) 및 분석 후(아래쪽 줄) 이미지.
눈금 막대: 200 µM.
뉴라이트 아웃그로스 솔루션 3
미세유체챔버(MFC)는 체질과 무관하게 축삭 구획에 대한 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 따라서 우리는 성인 야생형 마우스의 해리된 등쪽 뿌리 신경절(DRG) 뉴런을 사용하여 MFC에서 축삭 손상과 재성장에 대한 모델을 제공합니다. 뉴런을 MFC의 체세포 쪽에 이식한 지 3일이 지나면 이미 축삭돌기가 미세 홈을 통과하기 시작합니다. 배양 5일 후, 축삭은 홈을 완전히 가로질러 축삭 쪽에 아름다운 네트워크를 구축했습니다(그림 1 A). 그런 다음 축삭 구획에서 배지를 빠르게 제거하여 뉴런을 축삭화할 수 있습니다(그림 1 B).
발달 화합물은 체세포와 축삭실 사이의 정수압 차이를 이용하여 축삭 또는 체세포 쪽에만 선택적으로 적용할 수 있습니다.
차량 처리 세포와 비교하여 축삭 측에 NGF를 적용한 효과를 정량적으로 분석한 결과, 분지 및 축삭 길이가 유의하게 증가한 반면 교차 축삭의 수에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(그림 2).
그림 1. 미세유체 챔버에 있는 야생형 성체 마우스의 DRG 뉴런 대표 이미지. DRG 뉴런을 DIV5까지 배양하고 고정하기 전과 후를 비교했습니다. (A) 및 후 (B) 기계적 절제술. 뉴런과 그 확장을 시각화하기 위한 튜불린 III(TubIII) 라벨링과 핵을 염색하기 위한 DAPI. 축삭 절제술 전 축삭 측의 교차 축삭 (A) 및 축삭절제술에 의한 축삭의 제거 (B). 스케일 막대 1,000 µm.
그림 2. 축삭 절제술 후 24시간 후 축삭 재성장에 대한 NGF 치료의 효과. 교차하는 축삭의 총 수를 이미지 기반 정량화를 사용하여 다음 마커를 평가했습니다. (A), 교차 축삭당 가지점 수 (B) 및 모든 축삭의 총 길이 (C); n = 그룹당 웰 4개. 짝을 이루지 않은 t-검정; *p<0.05; **p<0.01. VC: 차량 제어; NGF: 신경 성장 인자.