신경 퇴행성 질환에 대한 미세아교세포의 중요성은 잘 알려져 있으며, 따라서 이 세포는 새로운 약리학적 개입의 표적으로 자주 사용됩니다.
잘못 접히거나 응집된 단백질의 포식작용은 시험관 내에서 효과적으로 연구할 수 있는 핵심 표적입니다.
아밀로이드-β
5xFAD 마우스의 분리된 성체 미세아교세포에 pH에 민감한 pHrodo™ Red 라벨과 결합된 Aβ1-42를 추가하면 인큐사이트® 라이브셀 이미징 시스템에서 적색 형광 증가로 측정 가능한 흡수 및 리소좀 분해를 모니터링할 수 있습니다.
pHrodo™ 적색 표지 Aβ1-42를 첨가한 후 8시간이 지나자 5xFAD 미세아교세포는 연령이 일치하는 비형질전환 미세아교세포에 비해 2배 이상의 형광 강도를 보였으며 이는 5xFAD 미세아교세포에서 Aβ의 강력한 식세포화를 반영합니다(그림 1A). 비형질전환 미세아교세포도 Aβ1-42의 식세포화를 보였지만, 5xFAD 미세아교세포의 매우 강력한 식세포화 반응은 시간이 지나도 지속되었고 마지막에는 세포 상청액에 남아있는 Aβ1-42를 측정하여 확인되었습니다. 5xFAD 미세아교세포는 비형질전환 미세아교세포에 비해 훨씬 더 많은 Aβ1-42를 흡수하여 상청액에서 현저히 감소된 Aβ1-42를 관찰할 수 있었습니다(그림 1B).
그림 1: 5xFAD 및 비형질전환(ntg) 동물의 분리된 성인 미세아교세포에서 Aβ1-42 식세포증 평가. Aβ1-42 식세포 작용은 48시간 동안 pHrodo™ 적색 표지 Aβ1-42 및 인큐사이트® 라이브셀 이미징(A)을 사용하여 측정했습니다. 48시간 배양 후, 동일한 세포의 상청액을 분석하여 잔류 Aβ1-42를 분석했습니다(B). n=5, 그룹당. 평균 ± SEM. A: 본페로니 사후 테스트를 사용한 이원 공변량 분석. B: 두 꼬리 비쌍검정 t-검정; ***p<0.001.
또는 생후 초기 일차 미세아교세포, 쥐 미세아교세포주 BV2(그림 2) 또는 iPSC 유래 미세아교세포도 화합물 치료에 대한 반응으로 Aβ1-42 흡수를 평가하기 위해 pHrodo™ Red 식세포증 분석에 사용할 수 있습니다.
그림 2: pHrodo™ 적색 표지 Aβ1-42 및 인큐사이트® 라이브셀 이미징을 사용한 BV-2 세포에서의 Aβ1-42 식세포화 평가. 4시간 후 pHrodo™ 적색 표지 Aβ1-42로 배양한 BV-2 세포의 주황색 형광을 보여주는 대표 이미지(눈금 막대 200µM).
타우 사전 형성 섬유소
응집된 Aβ와 마찬가지로 미리 형성된 타우 섬유(PPF)도 식세포 작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 pHrodo™ Red로 라벨링할 수 있습니다.
이 설정에서는 타우 PPF를 양성 대조군 또는 두 가지 음성 대조군(RI1 및 RI2) 중 하나를 항타우 dGAE(297-391) 항체와 함께 배양하고 iPSC 유래 미세아교세포에 추가하여 타우 PPF의 식세포화 차이를 모니터링했습니다 (그림 3).
그림 3: 타우 dGAE(297-391) 미리 형성된 피브릴(PFF) SPR-461의 포식작용. TI(항-인간 절단 타우 단편(AA297-391; dGAE) 다클론 항체 SPC-806D) 및 RI(RI1: Novus Biologicals IgG Fc 단편 항체 NBP2-47132; RI2: InVivoPlus 인간 IgG1 동형 컨트롤 BP0297) 유무에 따른 iPSC 유래 미세아교세포의 pHrodo™ 빨간색 표지 SPR-461 PFF의 식세포화. A: 주황색 물체 수 및 B: pHrodo™ 적색 표지 PFF 단독(VC) 또는 TI 또는 RI와 병용 처리한 세포에서 12시간 동안 주황색 신호의 총 통합 강도를 시간 경과에 따라 모니터링했습니다. 평균 ± SEM(n=6). 모든 시점에 대해 VC와 비교한 Dunnett의 다중 비교 테스트에 따른 이원 분산 분석(Two-way ANOVA). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
α-시누클레인 미리 형성된 원섬유
파킨슨병의 맥락에서 식세포 활성을 평가하기 위해, 인간 iPSC 유래 미세아교세포를 pHrodo™ 적색 표지 미리 형성된 α-시누클레인 섬유(PPF)와 함께 배양했습니다.
PPF를 토끼 항-인간 α-시누클레인 다클론 항체 SPC-800D를 양성 대조군 또는 두 가지 음성 대조군(RI1 및 RI2) 중 하나로 배양하여 α-시누클레인 PPF의 식세포화 차이를 관찰했습니다 (그림 4).
그림 4: N-말단 아세틸화된 α-시누클레인(α-syn) 미리 형성된 피브릴(유형 1; PFF) SPR-332의 포식작용 . TI(토끼 항-인간 α-시누클레인 다클론 항체, SPC-800D) 및 RI(RI1: Novus Biologicals IgG Fc 단편 항체 NBP2-47132, RI2: InVivoPlus 인간 IgG1 동형 제어 BP0297) 유무에 따른 iPSC 유래 미세아교세포의 pHrodo™ 빨간색 표지 SPR-332 PFF의 식세포화. A: 주황색 물체 수 및 B: pHrodo™ 적색 표지 PFF 단독(VC) 또는 TI 또는 RI와 병용 처리한 세포에서 12시간 동안 주황색 신호의 총 통합 강도를 시간 경과에 따라 모니터링했습니다. 평균 ± SEM(n=6). 모든 시점에 대해 VC와 비교한 Dunnett의 다중 비교 테스트에 따른 이원 분산 분석(Two-way ANOVA). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
또한 다른 질병 관련 펩타이드 및 단백질의 라벨링도 pHrodo™ Red로 가능합니다.
따라서 5xFAD 생쥐의 성체 및 출생 후 초기 일차 미세아교세포, 생쥐 미세아교세포주 BV-2 및 iPSC 유래 미세아교세포는 시험관 내에서 다양한 응집체의 식세포 작용을 연구하는 데 적합합니다.
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