Scantoxでは、前臨床試験パッケージの他に、お客様の研究ニーズを満たすための単独サービスも提供しています。 組織学的標識、生化学的分析、細胞培養のために、当社のトランスジェニック動物モデルの組織や細胞をご利用ください。 SCANTOXの細胞培養チームは現在、いくつかの神経細胞やグリア細胞の初代細胞や器官型脳スライスでの実験を提供しています。 組織学チームは現在、4重免疫蛍光標識と自動化された評価者に依存しない画像解析を提供しており、細胞培養実験の解析も行っています。
Scantoxは、トランスジェニックげっ歯類モデル以外に、6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）をラットの内側前脳束（MFB）に片側注射し、ドパミン作動性黒質経路の完全な脱神経をもたらすPDのモデル動物として、最も頻繁に用いられている。図1：Wistar Han系雄性ラットのMFBへの生理食塩水（A、B）または6-OHDA（C、D）の片側注射。 冠状脳切片の免疫蛍光標識により、6-OHDA注射後、同側の尾状核（CPu；C）および黒質（SN；D）において、チロシン水酸化酵素（TH；橙色）がほぼ完全に消失していることが明らかになった。 生理食塩水はTHの免疫反応性に影響を与えなかった（A, B）。 細胞核はDAPI（青）で標識した。 AとCの矢印はCPuを、BとDの矢印はSNを示す。 図2：6-OHDA病変ラットのシリンダーテスト。 MFBへの片側6-OHDA注射後の同側前肢使用。 6-OHDAは、生理食塩水を注射した対照動物と比較して、術後3、4、5週目に同側の前肢を使用する頻度を有意に増加させた。 列中の数字は群数（n）；平均値＋SEM；混合効果分析（Bonferroni´spost hoc検定付き）；***p<0.001。図3：アンフェタミンによる6-OHDA注射ラットMFBの同側回旋。6-OHDA注射3週間後のD-アンフェタミンに対する回転反応。 2.5mg/kgのD-アンフェタミンを試験日にi.p.注射した。 30分後、回転計ボウルで回転を分析した。 6-OHDAを注射したラットはほとんど同側回転しか行わなかったが、生理食塩水を注射したラットは同側回転と対側回転をほぼ同数行った (A). 6-OHDAを注射したラットは、生理食塩水を注射した対照ラットに比べて、60分間における同側の回旋の総数が有意に増加していた (B）；列中の数字は群数（n）；平均＋SEM、Mann Whitney検定：***p<0.001。6-OHDA誘発ラットモデルでの試験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください！
LPSで刺激された器官型海馬スライスは、in vitroで、発達段階の化合物が炎症酵素活性化に及ぼす影響を調べるのに最適のツールである。 生後脳の三次元構造と異なる細胞タイプの相互作用を維持することで、このシステムはin vivoの状況に酷似しており、同時に早期スクリーニングにいくつかの利点を提供する： いつでも上清を採取できる BBB透過性の問題に直面することなく、新規化合物を試験する。 準高スループット デキサメタゾンが参照化合物となりうる 以下に示すように、スライス組織内のNLRP3発現と上清中のIL-1β放出などを評価することにより、インフラマソームの活性化をモニターすることができる： 図1：LPS刺激24時間後のマウス海馬スライスにおけるNLRP3の定量。 A: 自動ウェスタンブロットシステム（WES）によるLPS刺激器官型脳スライスのNLRP3定量。B:WESで測定したLPS刺激器官型脳スライスのNLRP3曲線下面積（AUC）値。 整列ドットブロット；平均±SEM；各群n = 3 – 4。 デキサメタゾン（Dexa）を参照化合物とした。 一元配置分散分析（One-way ANOVA）後、Dunnettの多重比較ポストホックテストを行い、LPS処理群と比較した； ***p<0.001.図2：LPS刺激24時間後のマウス海馬スライスによるIL-1ß放出。 整列ドットブロット；平均値±SEM；各群n = 4 – 5。 デキサメタゾン（Dexa）を参照化合物とした。 一元配置分散分析（One-way ANOVA）後、LPS処理群と比較したDunnettの多重比較ポストホック試験; ***p<0.001。インフラムマソーム研究の開始については、今すぐお問い合わせください！
神経変性疾患研究におけるバイオマーカーとその使用は、研究の新分野を画定し、前臨床疾患モデルと患者における疾患進行の評価との間に重要なつながりをもたらす可能性がある。 神経細胞の細胞質タンパク質であるニューロフィラメント軽鎖（NF-L）は、軸索の損傷に起因する様々な神経細胞疾患で増加する。 ALS（筋萎縮性側索硬化症）患者では、NF-Lレベルの強い上昇が認められた（Gaetani et. al, 2018）。 そこで、低コピートランスジェニックマウスモデルSOD1-G93AでNF-Lレベルを調べた。 血漿中のNF-Lレベルの増加は、24週齢ですでに観察され、27週齢で有意になった（図1）。 家族性アルツハイマー病モデルマウス5xFADでは、血漿中NF-Lレベルの上昇が6ヶ月齢ですでに観察された（図2A）。 さらに、9ヵ月齢の5xFADマウスでは、CSF NF-Lレベルの強い上昇が検出される（図2B）。 図1：低コピーSOD1-G93Aマウスの血漿中のニューロフィラメント軽鎖の定量。 24週齢、27週齢、30週齢のSOD1-G93Aマウスの血漿中NF-Lレベル（pg/mL）と非トランスジェニック同腹子（ntg）の比較。 Two-way ANOVAとTukeyのポストホック検定。 平均値＋SEM。 *p<0.05; ***p<0.001。 *ntgとの比較；＃年齢群間の差。 図2：5xFADマウスの血漿および髄液中のニューロフィラメント軽鎖の定量。 A: 3、6、9、12ヶ月齢の5xFADマウスの血漿中NF-Lレベル（pg/mL）を非トランスジェニック同腹子（ntg）と比較。 二元配置分散分析とBonferroniのポストホック検定。B：9ヶ月齢の5xFADマウスの髄液中のNF-Lレベル（pg/mL）をntgと比較。 対応のないt検定。 AおよびB：平均＋SEM。 *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。ニューロフィラメント軽鎖レベルの研究組織分析については、今すぐお問い合わせください！
プラーク関連炎症に関心がありますか？ SCANTOXは、プラークに関連する炎症の可視化と定量化のパートナーです。 図1は、アミロイドβプラーク（6E10標識）に隣接するミクログリア（Iba1標識）を評価するための例示的な定量化プロセスである。 多チャンネル免疫蛍光法（1回の実験で最大4種類の抗体とDAPI標識）、全スライドイメージング、定量画像解析により、病理学的変化を詳細に評価することができる。 画像解析は、Image-Pro 10ソフトウェアを使用したマクロベースであるため、大量の画像バッチを迅速かつコスト効率よく定量化できる。 重要なことは、結果がオペレーターに依存せず、完全に再現可能であることである。 図1：10ヶ月齢の5xFADマウス脳切片の免疫標識と、プラークに関連したミクログリアの活性化を定量化するための解析過程。 A: アミロイドベータ（赤：6E10）とミクログリア（白：Iba1）のシグナルを合成；細胞核はDAPI（青）で標識。B-D：6E10のシングルチャンネルイメージ。 スケールバー：50 µm。(B）、Iba1（C）、DAPI（D）。E-I：定量化プロセス：まず、適切な閾値処理と形態学的フィルタリングにより、6E10免疫反応陽性物体（プラーク）を同定する（E）。 次に、評価された6E10陽性領域のマスク画像を作成し（F）、6E10陽性領域の境界を全方向に15μm拡張する（G、H）。 最後に、アミロイドβプラーク近傍のIba1陽性物体（活性化ミクログリア）を定量化した（I）。プラークに関連した炎症についてアルツハイマー病研究組織の解析をご希望の方は、今すぐお問い合わせください！
野生型マウスに三硝酸グリセリル（別名ニトログリセリン、NTG）を注射することは、片頭痛様症状を誘発するための迅速かつ強固な方法であり、利用可能な片頭痛治療薬で効率的に治療することができる。 片頭痛とそれに伴う頭痛や神経症状は、世界中で10億人以上の人々に影響を及ぼしている深刻な障害症状である。 片頭痛は最も一般的な神経疾患の一つであるが、それについてはまだあまり知られておらず、この病態を研究するための迅速なモデルの必要性が強調されている。 ニトログリセリン（NTG）の単回投与（1日目）と隔日投与（9日間）の繰り返しにより、野生型マウスの侵害受容が増加する（図1B）。 侵害受容は、スマトリプタンを投与することでベースラインレベルに戻すことができる。 最後のNTG注射から1週間後（16日目）には、全群が侵害受容のベースラインレベルに戻っており、NTG治療の急性効果を示している（Fig.1B）。 図1：野生型マウスにおける片頭痛様症状を示す侵害受容反応に対するニトログリセリン（NTG）の急性注射（1日目）および反復注射（1～9日目）の効果。 (A）3ヵ月齢の野生型マウスに、ニトログリセリン単独（NTG；10mg/kg、i.p.）またはスマトリプタン（スマ；0.6mg/kg、i.p.）と併用して注射し、注射レジメに従ってコントロールした。 (B）片頭痛様侵害受容反応に関連する顔の表情のスコア。 高得点は片頭痛様症状を示す。 下線を引いた1日目、9日目、16日目、注射2時間後にGrimace scaleをスコア化した。 1日目および9日目：n=24/群、16日目：n=12/群；二元配置分散分析（Bonferronipost hoctest）；平均値±SEM。 **p<0.01、***p<0.001。 片頭痛は3対1の割合で女性患者が男性患者より多く罹患する。 しかし、このマウスモデルでは、男女ともにニトログリセリン誘発性頭痛症状を示し（図2）、男女を問わず片頭痛研究のモデルとして有効である。 図2：男性（A）と女性（B）におけるニトログリセリン（NTG）注射の効果 (A)と雌 (B)マウスの侵害受容反応に及ぼす影響。 図1のデータを性別で分離。 1日目および9日目：n = 12 /群、16日目：n = 6 /群；二元配置分散分析（Bonferroniポストホックテスト付き）；平均値±SEM。 **p<0.01、***p<0.001。 このニトログリセリン誘発片頭痛モデルの特徴づけはまだ進行中であるが、最初の結果は、このモデルがin vivoで片頭痛病態を研究するための迅速で強固な選択肢であることを有望視するものである。片頭痛研究を開始するには、今すぐ弊社にご連絡ください！
AAV2 hA53T-α-synウイルス粒子を野生型マウスに片側注射することは、パーキンソン病の脳病態をモデル化するための迅速かつ確実な方法である。 AAV2 hA53T-α-synを黒質に一回片側注射すると、9週間後にはすでに同側半球の黒質だけでなく尾状核にもhA53T-α-synが選択的に発現する（図1）。図1：hA53T-α 黒質における-syn免疫反応領域（IR） (A)と尾状被殻 (B)における免疫反応領域(IR)。 同側半球の黒質に α-synを注射。 注射から9週間後に動物を安楽死させ、ヒト特異的α-syn抗体を用いて脳を評価した。 n = 5 /群; 対にしないt検定; 平均±SEM。 ***p<0.001。 さらに、神経炎症のマーカーとしてIba1で標識された活性化ミクログリアが、AAV2 hA53T-α-synを注射した半球の黒質で増加している。 チロシン水酸化酵素はAAV2 hA53T-α-synを注射した黒質で有意に減少しており、これは注射した半球でドーパミン作動系が障害されていることを示している（図2）。 図2：Iba1 (A)とTH (B）同側半球黒質へのAAV2 hA53T-α-syn注入後の対側および同側半球黒質における免疫反応領域（IR）。 注射9週後に安楽死させた。 n = 5 /群; 対にしないt検定; 平均±SEM。 *p<0.05; **p<0.01。 C：同側半球の黒質へのAAV2 hA53T-α-syn注射後の、対側および同側半球の黒質におけるhA53T-α-syn、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、Iba1およびDAPI標識の代表的な画像。 病態の発現が速いため、この新しいAAV2 hA53T-α-synはパーキンソン病in vivo試験の迅速な処理を可能にします。AAV2 hA53T-α-synマウスモデルでの試験を開始するには、今すぐお問い合わせください！
タウオパチー患者から精製したタウ凝集体をマウスの脳に注入すると、患者のタウオパチーの主な病理学的特徴を再現することができる。 このアプローチにより、タウオパチーに特異的な病態を解析することが可能となり、高いトランスレーショナルバリューを持つ。 注入には、ヒトタウを発現するが内因性タウを欠く9-10週齢のhTauマウスを用いた。 マウスは、AD BraakステージVI患者のサルコシル不溶性タウの種子を海馬とその上の頭頂皮質に片側注射された。 注射から12週間後に動物を犠牲にし、セリン202/スレオニン205（pSer202/pThr205）のリン酸化タウの病理学的変化について脳を分析した。 リン酸化タウは同側の大脳皮質と海馬だけでなく、対側半球でも測定可能であり、タウの播種と対側へのタウの拡散を示した（図1）。 図1：同側半球の海馬とその上の皮質に片側AD脳シードを注入した後、反対側半球と同側半球の頭頂皮質（A）と海馬（B、C）におけるpSer202/pThr205タウ免疫反応性。 注入12週後に安楽死させ、AT8抗体を用いて脳を評価した。 IR = 免疫反応領域。 n = 8 /群; 2-way ANOVAとŠídák´spost hoc検定による多重比較; 平均+SEM。 *p<0.05; ***p<0.001。 ニューロン、アストロサイトーシス、細胞核を標識するマーカーを用いた脳組織切片の免疫組織学的解析により、注射した同側半球の歯状回顆粒細胞層の構造変化が明らかになった（図2）。 図2：神経細胞体節のマーカーであるNeuN、アストロサイトーシスのマーカーであるグリア線維酸性タンパク質（GFAP）の免疫蛍光標識と、細胞核を可視化するためのDAPI染色。 タウシードを注入した同側と対照側の歯状回顆粒細胞層の構造変化に注目（白矢印頭）。 この結果は、AD患者由来のタウ凝集体の播種が、構造的・生理学的レベルでタウオパチーを忠実に模倣していることを示唆しており、したがってこのモデルがタウオパチーを研究するための貴重なツールとなっている。タウ播種研究の開始については、今すぐお問い合わせください！
超音波発声（USV）の測定は、げっ歯類の社会行動を研究するためのユニークで穏やかな方法を提供する。 マウスは、仔マウスが雌マウスから引き離されたときや、成熟した雄マウスが雌マウスに接触したときなど、生涯を通じてさまざまな社会的状況で超音波発声を行う。 後者の場合、オスのマウスは通常30～110kHzの超音波を発する。 これらの発声は、情動、社会的関心、意欲の指標と考えられている。 社会的コミュニケーション障害を測定するために、我々はFmr1-KOマウスを用いた。Fmr1-KOマウスは自閉症スペクトラム障害のモデルであり、異常な社会的表現型など幅広い行動異常を示すことが知られている。 10週齢のFmr1-KO雄および対照C57BL/6を用いて、性的に受容的な雌の尿に曝露したときのUSVエミッションの記録を確立した。 発声は、赤色光条件下でAvisoft技術を用いて5分間記録した。 発声の総数と、最初の発声が始まるまでの潜伏時間を、5分間の記録全体について測定した。 USV録音の結果、Fmr1-KOマウスは対照のC57BL/6マウスに比べて発声数が有意に減少した（図1）。 しかし、最初の呼びかけを開始するまでの潜伏時間は変わらなかった（データは示さず）。 図1. 超音波発声の回数。 5分間の録音セッション中の発声回数。 n=15／群；平均＋SEM（Students’ t-test、Mann-Whitneyのpost hoctestによる）； **p<0.01。 超音波発声の測定は、他のマウスモデル、異なる社会的文脈におけるマウス、あるいはラットの評価に容易に調整することができる。超音波発声の変化に関する動物実験をご希望の方は、今すぐお問い合わせください！
複合筋活動電位（CMAP）は、麻酔をかけた動物の筋肉の機能状態をモニターするために一般的に用いられている電気生理学的手法である。 CMAP測定は、末梢神経筋系の生理学的発達や変性に関する洞察を提供する。 筋電図（EMG）評価の一環として、CMAPはヒトの診断および臨床研究において定期的に使用されており、明確なトランスレーショナルバリューを提供している。 記録手順は、運動神経を上限の刺激で刺激し、筋からの反応を記録することからなる。 様々なCMAP特性の変化は、運動軸索の喪失、神経に沿った信号伝達速度の低下、筋力低下を反映するため、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、さらにはアルツハイマー病や ポンペ病のようなライソゾーム貯蔵疾患のような神経変性疾患に直接関連する。 SOD1-G93AALSモデルマウスのCMAP評価では、最大CMAP反応が著しく低下し（図1 A）、発症までの潜時（図1 B）、通常のCMAP持続時間（図1 C)、運動軸索の変性、神経から筋への信号伝達速度の低下、筋線維間の生理的同期が示唆された。 また、SOD1-G93Aマウスの筋は、反復刺激後にCMAP振幅の減少を示し（図2）、神経筋接合部の病的変化による筋力低下を示唆した。 図1：SOD1-G93Aマウスの腓腹筋における複合筋活動電位（CMAP）。 CMAP最大振幅 (A）、CMAP発現までの潜時 (B）、CMAP持続時間 (C）、CMAP持続時間と振幅の比 (D). 対応のないt検定。 n=8/群。 平均値＋SEM。 **p<0.01。図2：SOD1-G93Aマウスにおける腓腹筋の筋力低下。1回目の反応と5回目の反応を比較したときの誘発反応の変化。 (A)および10回目の反応 (B). 対応のないt検定。 n=6/群。 平均値＋SEM。 *p<0.05。SOD1-G93Aマウスの試験を開始するには、今すぐお問い合わせください！
FMR1遺伝子（Fragile X mental retardation 1）の変異は、Fragile X症候群（FXS）と呼ばれるX連鎖性遺伝性障害につながり、知的障害の中で最も頻繁に遺伝する形態であり、自閉症スペクトラム障害（ASD）の単発性原因である。 ASD患者は、コミュニケーションや社会性の障害、興味を制限された反復行動、多動性を示す。 エクソン5の200以上のCGGリピートをネオマイシン耐性カセットで置換することによってFMR1遺伝子をサイレンシングすることは、FXSとASDを研究するための貴重なツールとなる。Fmr1-KOマウスは、野生型マウスと比較して、社会的コミュニケーションの欠陥、高レベルの多動性、高レベルの反復行動を示す（2021年10月ニュースレター参照）。 Fmr1-KOマウスのこうした行動特性は、FXSやASDを調査し、新しく開発された化合物の有効性を試験するための貴重なツールとなっている。 Fmr1-KOマウスの脳組織を用いた新たな組織学的評価では、7週齢の雄マウスの尾状被蓋において、C57BL/6J動物に比べて活性化ミクログリアのレベルが増加していることが示された（図1 AおよびC）。 さらに、ミエリンを定量したところ、7週齢の雄性Fmr1-KOマウスの脳梁では、年齢をマッチさせたC57BL/6Jマウスと比較してレベルが増加していた（図1 BおよびD）。 神経炎症マーカーIba1とミエリン塩基性タンパク質（MBP）の代表的な画像を図2に示す。 これらのデータは、活性化ミクログリアのIba1と髄鞘形成レベルで評価される神経炎症が、薬効試験中の疾患の重症度やこれらのパラメーターの変化を解析するための貴重なマーカーになり得ることを示唆している。図1：7週齢のFmr1-KOマウスとB6マウスにおけるIba1とミエリン塩基性タンパク質の定量。尾状被蓋におけるIba1 IR面積と物体密度（Aおよび C). 脳梁のMBP IR面積と物体密度（Bと D). 非対t検定。 n=5/群。 平均値±SEM。 *p<0.05, ***p<0.001。図2：7週齢のC57BL/6JマウスとFmr1-KOマウスにおけるIba1（緑）、MBP（赤）、NeuN（青、CCのみ）の代表画像。尾状核（CPu）、脳梁（CC）。Fmr1-KOマウスの研究をご希望の方は、今すぐお問い合わせください！
培養細胞の自発的な神経細胞活動は、神経細胞の健康状態に関連する生理学的に最も関連性の高い読み出し値の一つである。 カルシウム濃度は、神経活動の有能な間接的レポーターとして神経科学で広く用いられている。活動電位（AP）発火は、電位依存性カルシウムチャネルを介したCa2+の大量流入を引き起こすからである。 IncuCyte®NeuroBurst（遺伝子コード化カルシウムインジケータ（GECI））をIncuCyte®ライブセルイメージングシステムと組み合わせることで、培養細胞内の数千の機能性ニューロンの形態学的変化をモニターし、ニューロン活動を長期間にわたって測定することができる。 神経細胞の自発活動を解析するために、ラットの初代神経細胞をNeuroBurstで形質導入し、DIV8まで培養する。 その後、処理を行う前に、IncuCyte® ライブセルイメージングシステムで細胞の自発的ベースライン活動を解析する。 細胞は 処理後6、12、24、48、72時間後に、IncuCyte®ライブセルイメージングシステムを用いて細胞の反応を再度モニターする。 3つの項目はすべて、それぞれのビヒクルコントロール（VC）と比較して期待される結果を示した。 MK-801処理は、その抗興奮活性を反映して活性ニューロンの減少をもたらすが、ピクロトキシンとフォルスコリンは活性ニューロン数を増加させる（図1A）。 フォルスコリンはさらに、投与開始から72時間後までのバースト率に影響を与え（図1B）、ピクロトキシンは神経細胞活動の相関性と同期性に強く速い影響を示した（図1C）。 図1：IncuCyte® NeuroBurstを用いた、治療に対する神経細胞活動の経時的モニタリング。 A：ウェルあたりの活性神経細胞数（記録時間あたり少なくとも1回バーストした対象）、B：1分あたりのバースト総数として示したバースト率、C：神経細胞活動の相関性を、すべての対象物の平均値として示したもの（0は完全にランダム、1は高度に同期している）。 データは、統合されたIncuCyte® Neuronal Activity Analysis Software Moduleにより作成された。 ビデオ96ウェルマイクロプレートに30,000cells/wellで播種したラット初代皮質ニューロンをIncuCyte® NeuroBurst Orange試薬に感染させ、ニューロン活動を徐々にモニターした。 DIV10（処理開始から48時間後；ピクロトキシン、フォルスコリン、MK801またはビヒクルコントロール（VC）による処理）に撮影した動画は、異なる処理による自発的な神経細胞活動（カルシウム振動）の変化を示している。 したがって、ラットの一次ニューロンを使用して、自発的なニューロン活動を評価することができる。 参照化合物として、ピクロトキシン、MK-801、フォルスコリンを用いることができる。
